耐药鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫药物筛选模型的建立及应用

黄晓会，徐阿晶*，俞 静，陈其琪，费爱华，卜书红

(1.上海交通大学医学院附属新华医院药学部,上海 200092；2.上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092；3.上海交通大学医学院附属新华医院急诊科，上海 200092)

细菌对抗生素的耐药性是全球关注的重要公共卫生问题之一[1]。近年来医院内感染呈上升趋势[2]，有些院内感染呈难治性，且为多重耐药，严重威胁到患者的健康和生命安全。鲍曼不动杆菌已成为国内各大医院住院患者感染中最常见的G-杆菌之一，近年来检出率不断上升，且耐药率有不断上升的趋势，多重耐药现象常见[3]，给感染的治疗造成很大的困难。针对多重耐药的难治性感染，临床医师往往根据经验联合使用抗菌药物。然而经验性治疗中，鲍曼不动杆菌感染患者的转归却不同，有些患者的病情能够得到缓解甚至治愈，而有些患者却最终死亡。因此，针对特定耐药鲍曼不动杆菌感染的最佳治疗，是快速、及时地筛选敏感药物和制定抗感染治疗方案，这是确保患者更好预后的重要策略。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)由于结构简单、通体透明、遗传背景清晰、生命周期短、易于实验室培养[4-6]，是一种国际公认、简单、有效的模式生物。本研究以鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫，并进行体内外药敏试验筛选抗菌药物，以期为临床个体化用药提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 抗菌药物均由上海交通大学医学院附属新华医院药库统一采购。哌拉西林钠(规格以哌拉西林计1 g/瓶，齐鲁制药有限公司)；头孢噻肟钠(规格以头孢噻肟计0.5 g/瓶，华北制药河北华民药业有限公司)；氨苄西林钠舒巴坦钠(规格0.75 g/瓶，其中含氨苄西林钠0.5 g，舒巴坦钠0.25 g)和头孢哌酮钠(规格以头孢哌酮计1.0 g/瓶，辉瑞制药有限公司)；亚胺培南(规格20 mg/瓶，美国默沙东公司)；头孢曲松钠(规格以头孢曲松计0.5 g/瓶，山东罗欣药业股份有限公司)；头孢吡肟(规格0.5 g/瓶，深圳信立泰药业股份有限公司)；美罗培南(规格0.5 g/瓶，Sumitomo Dainippon Pharma Co.,Ltd.)；头孢他啶(规格1 g/瓶)和两性霉素B(规格10 mg/瓶，上海新亚药业有限公司)；阿米卡星(规格200 mg/瓶，上海信谊金珠药业股份有限公司)；左氧氟沙星(规格0.5 g/瓶，第一三共制药有限公司)；环丙沙星(规格0.2 g/瓶，海南中化联合制药工业有限公司)；米诺环素(规格50 mg/粒，瀚晖制药有限公司)。线虫生长培养基(NGM)、M9缓冲液、琼脂粉、蛋白胨、叠氮钠(美国Sigma公司)，其余试剂为国产分析纯。NGM的配制方法为将3 g NaCl、17 g琼脂、2.5 g蛋白胨、1 ml含5 mg/ml胆固醇的95%乙醇溶液加入锥形瓶，加水至973 ml后，高压灭菌,然后加入以下经过高压蒸汽灭菌的溶液:1 ml浓度为1 mol/L的CaCl2溶液，1 ml浓度为1 mol/L的MgSO4溶液，25 ml浓度为1 mol/L的磷酸氢二钾溶液。pH值为6的M9缓冲液的配制：将15.12 g Na2HPO4·12H2O、5 g NaCl、3 g KH2PO4、0.25 g MgSO4·7H2O加入锥形瓶，加水至1000 ml。N2 野生型秀丽隐杆线虫和尿嘧啶缺陷型大肠杆菌由中国科学院遗传发育所惠赠。Olympus BX51荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 患者样本选择及临床疗效评价 本研究纳入65岁以上、实验室检查明确诊断为合并多重耐药鲍曼不动杆菌感染的患者3例，对患者进行病史分析。

1.3 菌株的鉴定及收集 从纳入研究的耐药菌感染患者的体液标本中分离出多重耐药鲍曼不动杆菌(AB112、AB113、AB114)进行培养，然后通过多重聚合酶链式反应(PCR)法和胶体金法进行菌种的鉴别。

1.4 体外药敏试验 患者体外药敏试验采用纸片法，用最低抑菌浓度(MIC)的折点数值进行敏感性评价，使用药物为鲍曼不动杆菌体外药敏试验常规使用药物。

1.5 秀丽隐杆线虫的同步化及鲍曼不动杆菌感染方法 从怀孕成虫分离虫卵，孵化过夜，得到L1期幼虫。将幼虫转移到普通琼脂平板上的鲍曼不动杆菌菌苔，在25 ℃培养箱中培养8 h进行感染。收集线虫生长良好的平板，用M9缓冲液将虫体洗下，1.21×104×g离心30 s，取上清，洗涤，将其置于含有氟尿嘧啶的培养板上，过夜培养。用M9缓冲液将虫体洗下，通过离心法同步化线虫，离心条件为1.21×104×g，时间20 s，取上清后，1.21×104×g离心20 s，重复2次。将得到的幼虫转移到NGM培养基上的尿嘧啶缺陷型大肠杆菌菌苔，在25 ℃培养箱中继续生长48 h，得到L4期青年成虫。用M9缓冲液洗脱虫体并反复清洗3～4次后，将虫体转移到普通琼脂平板上的耐药鲍曼不动杆菌菌苔，在25 ℃培养箱中培养8 h进行感染。感染后转移到96孔板的M9缓冲液中继续培养，观察并记录线虫每日死亡情况。线虫变成直线型、无移动、用铂金丝轻触无反应等判为死亡(见图1)。

1.6 抗菌药物储备液的制备及最佳浓度的确定 本研究使用的药物均为特定病原菌体外药敏试验常规使用药物及其他候选药物，具体见1.1项材料部分。用药品说明书要求的注射用水配制药物浓度为2 mg/ml的储备液, 配制完成后用直径为0.45 μm的滤膜过滤，置4 ℃冰箱保存备用。

用96孔板进行药物筛选。配制药物浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9 μg/ml的系列溶液，每种药物做两份平行复孔。将耐药鲍曼不动杆菌感染后的虫体加入孔中，每孔10～30条。置25 ℃培养箱中培养5 d，培养箱相对湿度为80%～85%。5 d后观察两板中线虫在每种药物不同浓度下的存活情况，存活线虫比例最高的药物浓度作为最佳药物浓度。

1.7 体内药敏试验 在96孔板中进行线虫体内药敏试验，每孔加入最佳浓度的候选抗菌药物20 μl，每种药物各4个复孔，其中未感染耐药鲍曼不动杆菌的线虫加入药物作为阴性对照，感染耐药鲍曼不动杆菌的线虫不加药物作为阳性对照。每孔中加入M9缓冲液冲洗过的同步化后的线虫溶液，每孔约20条线虫。铺好96孔板，计数线虫，以后每隔12 h计数存活线虫，连续7 d计数，计算线虫生存率的变化。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.01软件进行统计分析。采用Kaplan-Meier方法进行生存分析，用χ2检验进行体内、体外药敏之间的相关性分析。

2 结 果

2.1 最佳感染时间的确定 按照1.5项下方法操作，通过观察和对比，选择最合适的感染时间为线虫过夜感染8 h。

2.2 最佳药物浓度的确定 按照1.6项下方法处理后，选出各药物的最佳浓度，结果哌拉西林钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢哌酮钠为250 μg/ml；氨苄西林钠舒巴坦钠、亚胺培南、头孢吡肟、头孢他啶、美罗培南、左氧氟沙星为125 μg/ml；环丙沙星、阿米卡星为62.5 μg/ml；两性霉素B、米诺环素为31.25 μg/ml。

2.3 不同抗菌药物的治疗效果 按1.7项下方法处理后，记录线虫存活数量，并绘制其生存曲线(见图2)。由图2可见，美罗培南、亚胺培南、氨苄西林钠舒巴坦钠和米诺环素对感染耐药鲍曼不动杆菌的秀丽隐杆线虫的治疗效果较好，左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星对其也有不同程度的治疗作用。

2.4 体内、体外药敏试验对比 体外药敏试验结果显示，耐药鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药，但体内药敏试验显示，这两种药物对鲍曼不动杆菌感染的秀丽隐杆线虫显示出较好的疗效， 延长了线虫的生存时间，提高了生存率，与体外药敏试验结果比较有明显差别。氨苄西林钠舒巴坦钠的体内、体外药敏试验结果也有不同，体外药敏试验结果只有一例为中度敏感，而体内药敏试验却显示可明显延长耐药鲍曼不动杆菌感染的秀丽隐杆线虫的存活时间。第三代、第四代头孢菌素类药物头孢曲松钠、头孢吡肟、头孢噻肟钠、头孢他啶在耐药鲍曼不动杆菌的体外药敏试验中基本无效，且在线虫体内药敏试验中也不敏感。哌拉西林钠等青霉素类在耐药鲍曼不动杆菌的体外药敏试验中无效，在线虫体内药敏试验中也不敏感。四环素类米诺环素在体内药敏试验中可以延长耐药鲍曼不动杆菌感染的线虫的存活时间，体外药敏试验中耐药鲍曼不动杆菌对米诺环素也敏感。研究结果提示，头孢菌素类药物、青霉素类+β-内酰胺酶抑制剂类药物、四环素类米诺环素的体内、体外药敏试验结果是一致的。结果见表1。

3 讨 论

鲍曼不动杆菌不是线虫的常规食物。有研究表明，线虫能区分不同细菌的气味从而拒食对其有害的食物[4]。因此本研究直接将线虫加入耐药鲍曼不动杆菌培养板中，这样可以避免线虫避开感染菌而聚集于空白区域，达不到感染目的。在选定感染菌条件的基础上，需要验证不同感染时间对线虫的感染效果，选择最合适的感染程度，既达到一定的感染程度，又留有治疗起效和观察的时间[4]。本研究通过观察和对比，选择最合适的感染时间为线虫过夜感染8 h。

表1 体内、体外药敏试验结果比较Table 1 Comparison of the results of drug sensitivity tests in vivo and in vitro

a：多重耐药鲍曼不动杆菌；I：中度敏感；S：敏感；R：耐药；+：低度敏感；++：中度敏感；+++：高度敏感；-：耐药

本研究结果提示，部分药物体内、体外药敏试验结果存在明显差异。因此，仅根据传统的体外药敏试验结果制定的治疗方案，可能会对细菌本身具有的交叉耐药性、细菌耐药率变化缺乏综合考虑，常常出现抗菌药物用法用量滞后于病情变化等情况。有些敏感药物可能通过作用于宿主，增强宿主自身免疫力等机制来抵抗病原菌感染。因此，对在线虫体内有抗感染活性的药物，还需要对照体外抑菌试验结果及患者临床治疗效果进行综合评价。

鲍曼不动杆菌对目前使用的多种抗菌药物耐药，其产生耐药的机制比较复杂，包括产生β-内酰胺酶和氨基糖苷修饰酶等灭活酶、改变药物的作用靶点、降低药物的通透性、增加主动外排、基因突变等[7]。传统的体外药敏试验是以血药浓度为基础制定的标准，缺乏对局部感染的药敏判断标准，也无法较好地反映病原菌和药物在体内的动态变化。尽管临床治疗可以根据体外药敏试验结果，考虑选用碳青霉烯类、含舒巴坦的复合制剂，或联合使用抗菌药物等治疗鲍曼不动杆菌感染，但严重存在的鲍曼不动杆菌耐药性需要用药时更密切地观察药物的疗效, 并及时调整用药方案。

鲍曼不动杆菌药物治疗现状不容乐观。本研究选用秀丽隐杆线虫为实验对象，进行体内多重耐药鲍曼不动杆菌感染的药敏试验，并将其结果与体外药敏试验结果比较，可以弥补传统的体外药敏试验筛选中的不足，具有临床参考价值。但是本领域的工作刚起步，还不能替代体外药敏试验，尚需要更多的深入研究，以期未来能在临床工作中发挥作用。