用LC-MS/MS法测定人血清中替加环素的浓度

唐 棠，黄晓晖，李 婷，李 辉

(东部战区总医院药理科，南京 210002)

替加环素(tigecycline，TGC)是近年上市的一种甘氨酰四环素类抗菌药物，它能与细菌核糖体的30S亚基结合，通过阻断细菌蛋白质的合成发挥抗菌作用[1]。TGC在临床上可用于治疗多种严重感染，特别是复杂的腹腔感染、血流感染等，被誉为抗感染治疗的最后一道防线[2-3]。随着TGC应用范围的扩大，医护人员逐渐发现其使用后血药浓度个体差异大，甚至使用后死亡率增加[4]。因此，在临床应用中把控TGC的有效性和安全性极为重要。

血液中游离药物浓度可间接反映靶标部位活性药物的浓度，而药物的疗效取决于靶标部位活性药物的浓度。本研究旨在建立一种可以快速、稳定、准确检测人血清中TGC浓度的方法，以确保患者用药安全、有效，同时为TGC药动学研究及临床合理用药提供依据。TGC在室温光照条件下不稳定且临床样本基质复杂，含量测定难度大。目前对其测定主要采用HPLC法[5-6]和LC-MS/MS法[7-10]。因HPLC法易受内源性物质干扰，多用于检测药品中TGC的含量[5-6]，不适合临床复杂样本的测定。已报道的LC-MS/MS法存在样本前处理复杂、检测时间长和灵敏度不够等问题[7-10]，不利于临床大样本量的测定和药动学研究。本研究以米诺环素为内标，建立了测定血清中TGC浓度的LC-MS/MS法。该方法准确、灵敏、稳定，操作简便，已成功用于临床样本的检测。

1 材 料

1.1 仪器 API4000质谱仪(美国Sciex公司)；1260 Infinity液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)；XS205DU电子分析天平(精度0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司)；WH-3涡旋振荡器(上海沪西分析仪器厂)；2-6E低速离心机、1-13高速离心机(美国Sigma公司)。

1.2 药品和试剂 TGC对照品(纯度99%，批号291641)、甲酸(纯度98%，批号299272，北京百灵威科技有限公司)；米诺环素对照品(批号101859403，上海Sigma-Aldrich公司)；甲醇(批号17060806，美国Tedia试剂公司)；乙腈(批号1857729707，德国Merck Millipore公司)；超纯水(美国Millipore公司)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱采用Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流动相：A相为水(含0.1%甲酸)，B相为甲醇∶乙腈=1∶ 3(含0.1%甲酸)，梯度洗脱：0～1 min，95%A；1～7 min，95%～5%A；7～8 min，5%A；8～8.5 min，5%～95%A；8.5～10 min，95%A；流速：0.3 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；以米诺环素为内标。

2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，检测方式为多离子反应监测(MRM)正离子扫描。去簇电压分别为110 eV(TGC)和95 eV(内标)；碰撞能量分别为36 eV(TGC)和24 eV(内标)；扫描时间为100 ms。用于定量分析的离子对分别为：m/z586.4→513.4(TGC)，m/z458.2→441.2(内标)。典型的碎片离子图见图1。

2.3 溶液的配制 精密称取TGC对照品5.00 mg、米诺环素对照品2.00 mg，分别置于5 ml、2 ml容量瓶中，加50%甲醇-水溶液溶解并定容至刻度。摇匀，得质量浓度为1.0 mg/ml的TGC、米诺环素储备液，均于-20 ℃保存。用流动相分别依次稀释TGC、米诺环素储备液，配制得到所需质量浓度的TGC标准溶液和质量浓度为785.0 ng/ml的内标溶液，均于-4 ℃保存备用。

2.4 样品的前处理 取20 μl人血清样本置1.5 ml Eppendorf(EP)管中，加入20 μl流动相，再加入5 μl内标溶液(785.0 ng/ml)，涡旋混合10 s，加入沉淀剂(甲醇∶乙腈=1∶3，含0.1%甲酸)80 μl，涡旋混合1 min，1.190 3×104×g离心5 min，取上清液进样分析。

2.5 专属性实验 分别选取6例不同来源的空白血清样本，加入TGC标准溶液的血清样本(加入内标溶液)和患者用药后血清样本(加入内标溶液)，按2.4项下方法处理后进样测定。测得TGC和内标的保留时间分别约为6.0和6.7 min，峰形良好，且血清中内源性物质对TGC及内标的测定不产生干扰，见图2。

2.6 线性及定量下限 取TGC储备液配成浓度为11.3、33.9、101.6、304.9、914.7、2 744.0 ng/ml的TGC标准溶液。取空白血清20 μl置1.5 ml EP管中， 分别加入20 μl不同浓度的TGC标准溶液，再加入5 μl内标溶液(785.0 ng/ml)，其余步骤按2.4项下方法操作。以待测物与内标峰面积比值(Y)为纵坐标，待测物浓度(X，ng/ml)为横坐标，用加权最小二乘法作回归运算，得线性方程为Y=1.62×10-4X-2.6×10-4(r=0.999 0)。结果表明，TGC血清浓度在11.3～2 744.0 ng/ml范围内线性关系良好，定量下限为11.3 ng/ml。

2.7 精密度和准确度的测定 分别配制TGC定量下限质量浓度(11.3 ng/ml)的血清样本和高、中、低质量浓度(2 287.0、457.3、91.5 ng/ml)的质控样本，按2.4项下方法处理，每个浓度取5个样本分析，连续测定3 d。根据当日标准曲线计算各样本实测浓度，考察本方法的准确度和精密度，以测得浓度与理论浓度的比值计算方法回收率，结果见表1。结果测得日内RSD为2.7%～5.8%，日间RSD为4.3%～8.9%，方法回收率为97.6%～105.3%(n=5)，表明本方法的准确度和精密度均符合生物样品分析要求。

表1 血清中替加环素浓度测定的精密度和回收率实验结果Table 1 Results of precision and recovery rate tests of the concentration determination of tigecycline in human serum (n=5)

2.8 提取回收率和基质效应 分别配制TGC高、中、低浓度(2 287.0、457.3、91.5 ng/ml)的质控样本，按2.4项下方法处理，每个浓度取5个样本分析。将人空白血清按2.4项下方法处理，取上清液分别加入TGC高、中、低浓度的质控样本，混匀后进样测定，每个浓度平行测定5个样本。在流动相中分别加入TGC高、中、低浓度的质控样本，混匀后进样测定，每个浓度平行测定5个样本。TGC或内标的基质效应=经过前处理的空白基质配制的样本的峰面积/溶剂配制的样本的峰面积×100%；TGC或内标的提取回收率=血清配制的样本的峰面积/经过前处理的空白基质配制的样本的峰面积×100%。结果表明，本方法在不同质控浓度下的基质效应为98.1%～102.4%，提取回收率在69.3%～73.0%，见表2。

表2 血清中替加环素浓度测定的基质效应和提取回收率实验结果Table 2 Results of matrix effect and recovery rate tests of the concentration determination of tigecycline in human serum (n=5)

2.9 稳定性实验 配制TGC高、中、低3个浓度(2 287.0、457.3、91.5 ng/ml)的质控样本，按2.4项下方法处理后，考察室温放置4 h、4 ℃放置24 h、反复冻融3次、-20 ℃冰冻放置5 d和自动进样器(4 ℃)放置8 h的稳定性。结果表明TGC在上述条件下稳定性良好。

2.10 临床应用 重症胰腺炎患者TGC给药方案为首剂静脉滴注50 mg，后为50 mg，q12 h，分别于第7次给药前(0 h)及给药后1、1.5、3、6、12 h取血，末次给药静滴时间为1 h。采用本研究建立的方法测定其中3例患者TGC的血清浓度，其血药浓度-时间曲线见图3，经计算AUC0～12 h分别为6.56、3.01和2.34 μg·h·ml-1。

3 讨 论

随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药问题越发严重，尤其是多药耐药和泛耐药菌的出现，已成为威胁人类健康的重要危机[11-12]。目前，临床上治疗耐药G-菌可选择的抗菌药物不多，而TGC因其广谱有效的抗菌活性成为治疗耐药G-菌感染的重要药物。近年来，随着TGC应用范围的扩大，逐渐出现了耐TGC的细菌，同时医护人员也发现TGC可能会导致死亡率增加等[4]，因此为保证患者用药的安全性和有效性，监测用药期间TGC的血药浓度十分重要。

本研究以米诺环素为内标，建立了人血清中TGC的LC-MS/MS测定方法。不同于廉洪等[7]和梅升辉等[8]在流动相中加入三氟乙酸,本研究流动相采用含0.1%甲酸的水-甲醇-乙腈体系，避免使用危险性较高的三氟乙酸且不易腐蚀仪器。与Munyeza等[9]和Ozcimen等[10]的方法相比，样本处理更简便、快捷，仅采用一步沉淀法，适合临床大样本量的测定，且方法专属性好，不受血浆内源性物质的干扰，无残留效应，与文献[7-9]相比，检测下限更低,可应用于TGC药动学的研究。临床检测数据也证实重症胰腺炎患者的TGC血药浓度个体间差异大，峰浓度及AUC0～12 h不同患者间差异可接近3倍。