包载NLG919的乳腺癌靶向纳米胶束的构建及体外评价

李国瑞，韩治敏，宫春爱，田 泾，高 申*

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海200433；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院药学部,上海200011)

乳腺癌是常见的女性恶性癌症之一，发病率上升迅速。近年来，以免疫治疗为代表的乳腺癌治疗新进展为肿瘤的治疗开辟了新的途径。机体免疫细胞可识别体内偶然出现的肿瘤细胞，并将其作为异物清除，但肿瘤在机体的免疫监视下仍能发生、发展和转移[1]。在这个过程中，肿瘤细胞会通过多种途径激活免疫检查点，如吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)等，以逃避免疫清除。IDO是色氨酸分解代谢为犬尿氨酸的限速酶，肿瘤细胞内过度激活的IDO会导致色氨酸的耗竭和犬尿氨酸的积累，进而通过激酶信号通路抑制T细胞的增殖和活性[2]。因此,抑制IDO的活性可有效解除肿瘤微环境中T细胞的免疫抑制状态，恢复T细胞的免疫清除能力。NLG919是高效的IDO抑制剂，但因其水溶性差(25 ℃时溶解度<1 mg/ml)[3]，生物利用度低，临床应用受到限制。

以多肽结构为基础的纳米胶束体系，因递送难溶性药物的优势受到了极大的关注。功能各异的多肽具有靶向肿瘤细胞、诱导细胞凋亡等作用，为构建新型载体提供了新的可能。本研究以具有靶向乳腺癌肿瘤细胞作用的多肽Lin TT1[4]，具有质子海绵效应的组氨酸[5]和胆固醇为基础，构建一种乳腺癌靶向的多肽载体CHL，包载IDO抑制剂NLG919，制备NLG919-CHL纳米胶束,通过研究其载体表征，考察细胞摄取和体外释放等性质，并初步研究其抑制犬尿氨酸生成的作用，为乳腺癌的肿瘤免疫治疗提供有益的参考。

1 材 料

1.1 仪器 Zeta sizer nano ZS90 粒度电位分析仪(英国Malvern公司)；激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；全自动酶标仪(美国Thermo公司)；透射电子显微镜(日本 Hitachi公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 试剂 胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；Cell Counting Kit-8细胞活性检测试剂盒(CCK-8试剂盒,日本Dojindo公司)；NLG919(美国Selleck Chemicals公司)；尼罗红(Nile red，北京索莱宝科技有限公司)；重组小鼠干扰素-γ(IFN-γ，美国PeproTech公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,上海碧云天生物技术有限公司)；2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU试剂)、苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU试剂)、丙烯酸(AA)、N-甲基吗啡啉(NMM，浙江鸿拓生物技术股份有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞 小鼠乳腺癌肿瘤细胞4T1和人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7由中国科学院生命科学研究院细胞库提供。

2 方法和结果

2.1 细胞培养 小鼠乳腺癌肿瘤细胞4T1使用含有10% FBS的RPMI-1640培养基，在5% CO2、37 ℃条件下培养，每3 d传代一次，约达到80%细胞融合时进行实验。人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7使用含有10% FBS的DMEM培养基，在5% CO2、37 ℃条件下培养，每3 d传代一次，约达到80%细胞融合时进行实验。

2.2 胆固醇修饰的多肽载体的合成与鉴定 采用固相合成法合成胆固醇修饰的多肽单体，序列为Chol-HHHHHHH-AKRGARSTA(简称CHL)。称量取代度为0.35 mmol/g的多肽合成树脂Fmoc-Ala Wang Resin 0.857 g[含丙氨酸(Ala)0.3 mmol]，置于反应炉中，加入适量二甲基二酰胺(DMF)溶解后浸泡120 min，加入3倍体积的20%聚吲哚高氯酸盐/二甲基二酰胺(Pip/DMF),向反应炉中鼓入氮气30 min,用以脱除Fmoc,再加含0.3 mmol苏氨酸(Thr)与反应缩合剂的混合液(Thr∶HBTU∶NMM=3∶2.85∶6)反应生成Thr-Ala Wang Resin，依照序列顺序，依次加入其他氨基酸，重复上述方法完成HHHHHHH-AKRGARSTA Wang Resin的合成。再加入胆固醇与缩合剂的混合物(胆固醇∶HATU∶NMM=3∶2.85∶6)，鼓入氮气进行反应，合成Chol-HHHHHHH-AKRGARSTA Wang Resin，抽干反应器内树脂完成CHL的合成。将合成物转移至切割管，收集切割滤液置离心管中，加入6倍体积冰乙醚，4 ℃离心(1.5×103×g)10 min，取沉淀物，用乙醚洗3遍，得最后粗品。粗品真空干燥过夜，用反向高效液相色谱纯化后得到精品。

2.3 NLG919-CHL纳米胶束的制备 采用透析法制备NLG919-CHL纳米胶束[6]。取1.5 mg NLG919溶于3 ml 二甲亚砜(DMSO)，涡旋30 s，形成悬浊液。另取3 mg CHL溶于3 ml DMSO中，振匀，制成CHL-DMSO溶液。边搅拌边用滴管将悬浊液逐滴滴加到CHL-DMSO溶液中，然后将混合溶液置于磁力搅拌器上以200 r/min搅拌2 h至液体呈澄清透明状态，转入1000 u的纤维素透析袋中。将密封的透析袋置于500 ml去离子水中透析12 h，分别在第1、2、4、6、8、10 h时换液一次。12 h后将透析袋中液体用220 μm的针式滤膜过滤掉未包载的NLG919，将收集的滤液在-80 ℃冰箱中预冻2 h后，置于预先启动冷冻干燥机的冰阱中，启动真空泵，冻干过滤液后形成的固体粉末即为NLG919-CHL。空白胶束Blank-CHL除了制备过程中不加入NLG919，其他操作同上。

2.4 NLG919-CHL的表征 取0.2 mg制备好的 NLG919-CHL复溶于1 ml水中，制成NLG919-CHL溶液。取0.1 ml溶液，用粒度电位分析仪测得NLG919-CHL的粒径为(197.50±2.33) nm，聚合物分散性指数(PDI)为0.26±0.033。

胶束的形态通过透视电子显微镜进行观察。分别取适量NLG919-CHL用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，制成1 μg/ml溶液，将200目铜网浸没在制备好的溶液中。取出铜网，用滤纸吸干，低温烘烤至铜网完全干燥，于透视电子显微镜下观察(加速电压为75 kV，放大倍数20 000倍)，并拍照记录(见图1)。由图1可见，胶束呈球形，而且粒径大小和粒度电位分析仪测得数据一致。

2.5 载药量和包封率的测定 取200 μl NLG919-CHL溶液，加入甲醇800 μl，超声20 min，破坏胶束结构使游离出NLG919。由于NLG919易溶于甲醇，采用HPLC法测定NLG919的峰面积，通过标准品外标法推算出胶束中NLG919的质量。色谱条件：Agilent Technologies C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为5%乙腈-95%水(含0.1%H3PO4)；流速：0.45 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长270 nm。载药量(DL)=胶束中药物的质量/载药胶束的质量×100%，包封率(EE)=胶束中药物的质量/投入药物的质量×100%。计算得到载药量及包封率分别为(21.04±0.002)%和(63.30±0.011)%。

2.6 空白胶束Blank-CHL临界胶束浓度(CMC)的测定 聚合物胶束通常需要较低的CMC，以确保在生理条件下保持稳定和在靶部位的蓄积[7]。本研究采用芘荧光探针测定CMC。先配制浓度分别为1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg/ml系列浓度的空白胶束溶液，再以丙酮为溶剂制备6×10-6mol/L的芘-丙酮溶液。分别将1 ml芘-丙酮溶液滴于1.5 ml的Eppendorf(EP)管中，于通风橱中避光过夜，待丙酮挥发干后，加入上述制备的空白胶束溶液各1 ml，于25 ℃孵育2 h后，用荧光分光光度计分别测定各溶液的荧光图谱。荧光扫描的激发波长为333 nm,激发狭缝设置为5.0 nm,发射狭缝设置为2.5 nm,扫描速度为500 nm/min, 记录273 nm和383 nm处的荧光值I1、I3。以空白胶束浓度的对数(logc)为横坐标，I1/I3为纵坐标作图，拟合线的交叉点即为CMC，为1.9 μg/ml。

2.7 体外释放的考察 多肽载体以内吞的方式被细胞摄取。被细胞内吞后，多肽载体与生物膜最终形成内涵体而进入细胞内。在内涵体酸性环境下，多肽载体的组氨酸结构通过质子海绵效应使得载体发生溶胀而释放药物。为考察胶束在内涵体酸性环境中的释放能力，用PBS来模拟内涵体环境，分别考察NLG919-CHL在pH值为7.4和5.0环境中的药物释放能力[8]。取2 ml NLG919-CHL溶液置透析袋中(分子截留量2000 u)。将两个密封的透析袋分别置于300 ml盛有 pH值为7.4和5.0的PBS的大烧杯中，于磁力搅拌器上以37 ℃，100 r/min搅拌。分别于搅拌后第2、4、6、8、10、12、24、48 h各取1 ml PBS进行检测，并补加1 ml PBS以确保缓冲介质总体积不变。按2.5项下色谱条件测定不同时间点NLG919的含量，进而计算出不同时间点药物的释放度，结果见图2。由图2可见，48 h内，在pH=5.0时，NLG919从胶束中的释放达到了80%，而在pH=7.4时仅有50%。CHL胶束在pH=5.0时的快速释放归因于载体多肽结构中的组氨酸序列，组氨酸结构中的咪唑基团的pKa约为6.0，咪唑基团在微酸性环境下发生质子化作用，减弱了胶束与NLG919之间的疏水相互作用，导致胶束的致密性降低，药物在pH=5.0时迅速释放。

2.8 空白胶束Blank-CHL细胞毒性的考察 载体的生物安全性对药效评价具有重要意义。本研究采用CCK-8试剂盒分别检测空白胶束Blank-CHL对4T1和MCF-7细胞的细胞毒性。在细胞培养到80%融合时，用胰酶消化并计数，以5000个细胞/孔接种到96孔板中，细胞贴壁生长24 h后移除旧的培养基。Blank-CHL冻干粉用PBS复溶后，溶于不含血清的培养基，制成浓度分别为0、10、20、50、100、200 μg/ml的样品。每孔加入100 μl样品培养24 h后，培养板移去旧的样品，重新加入90 μl培养基和10 μl CCK-8试剂，然后于50 ℃孵育箱中放置2 h。取出培养板置于酶标仪振荡30 s，然后在450 nm波长处测定各个孔的吸光度(A)。空白组未接种细胞，对照组未加入药物。每个孔重复测量6次，计算各组细胞存活率，细胞存活率(%)=[1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。相对细胞活力为各组细胞存活率与未加入药物组细胞存活率的比值，结果见图3。

由图3可见，在载体浓度为200 μg/ml时，相对细胞活力>90%。说明载体本身的毒性较低，可以排除实验中因为载体毒性所引起的细胞活力的下降。

2.9 CHL纳米胶束细胞递送能力的考察 采用激光共聚焦(CLSM)法进一步研究CHL将药物递送入4T1和MCF-7细胞的能力[9]。采用具有荧光的尼罗红代替NLG919制备尼罗红-CHL纳米胶束，考察其在细胞内的分布。将圆形玻璃片在75%乙醇中浸泡30 min后取出，在酒精灯上烤干后放入24孔板，分别将4T1和MCF-7细胞接种到24孔板，每孔5×104个细胞。培养24 h后，移去旧的培养基，加入不含血清的培养基，分别加入尼罗红溶液(尼罗红用DMSO溶解后制成母液，临用时用PBS稀释)和尼罗红-CHL，于37 ℃、5% CO2中培养4 h后，吸去培养基，用PBS洗1次，再用预冷的4%多聚甲醇固定30 min，PBS洗3次。吸取8 μl含有 DAPI 的封片液滴于载玻片上，将圆形盖玻片取出，使含有细胞的一面贴于含有DAPI液的载玻片上。用透射电子显微镜观察并记录尼罗红在 4T1和MCF-7细胞内的荧光分布情况，见图4，其中红色荧光代表尼罗红，蓝色荧光代表DAPI。尼罗红组未见红色荧光，说明单纯尼罗红无法进入细胞，即细胞无法摄取尼罗红。尼罗红-CHL组中，尼罗红的红色荧光与细胞核的蓝色荧光重合，说明在CHL载体的介导下有更多尼罗红进入细胞质。

2.10 NLG919-CHL对IDO的抑制作用 IDO可以诱导细胞内的色氨酸向犬尿氨酸代谢，所以用犬尿氨酸的产量来研究NLG919和NLG919-CHL对4T1和MCF-7细胞IDO的抑制作用。4T1和MCF-7细胞以5×103个细胞/孔接种到96孔板,培养过夜，更换含有IFN-γ的新鲜培养基刺激肿瘤细胞IDO的表达[10]。同时,将不同浓度的NLG919-CHL胶束(相当于NLG919浓度0、1、5、10、20、100、200 μmol/L)加入96孔板,经过12 h的培养后,取100 μl上清液加入75 μl 30%三氯乙酸溶液，于50 ℃烘箱中放置30 min，将 N-甲酰犬尿氨酸(色氨酸向犬尿氨酸代谢的中间产物)水解为犬尿氨酸。取出后在室温下加入等体积的Ehrlich试剂[2%对二甲胺基苯甲醛的冰乙酸溶液(w/V)]孵育10 min。用全自动酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度，以空白组为对照，计算各组犬尿氨酸生成的相对抑制率[3]，结果见图5。由图5可见，NLG919-CHL对犬尿氨酸生成的抑制作用和单独的NLG919给药组类似，均呈现出浓度依赖性，而在生理状态下NLG919-CHL组的抑制率低于NLG919单独给药组，这与NLG919从CHL胶束中的释放度相关。

3 讨 论

NLG919作为IDO的高效抑制剂，通过抑制细胞内IDO的活性，抑制色氨酸代谢为犬尿氨酸[2-3]，解除免疫抑制状态，对机体免疫功能的恢复具有重要的作用。但NLG919因疏水性造成生物利用度低，同时在体内不具有靶向性，限制了其临床应用。

本研究以胆固醇修饰的靶向多肽为载体，通过透析法制备NLG919-CHL纳米胶束,可以提高NLG919的溶解性。胆固醇修饰的多肽载体具有的乳腺癌靶向性可以将NLG919递送到肿瘤部位，增加细胞对于药物的摄取，提高药物的生物利用度。

本研究制备的NLG919-CHL纳米胶束粒径为(197.50±2.33) nm。有文献指出粒径在5～200 nm的纳米粒，可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应 (enhanced permeability and retention effect，EPR)被动地积聚在肿瘤部位[11]，并且在载体设计过程中引入的具有主动靶向作用的Lin TT1结构基团[4]可以引导载体聚集在肿瘤部位，这些设计都赋予了载体体内靶向的能力。通过芘荧光探针测定空白胶束的CMC为1.9 μg/ml，较低的浓度可以保证胶束在血液中保持胶体特性。本研究采用CCK-8法测得空白胶束Blank-CHL的细胞毒性低，具有高安全性的特点，可见NLG919-CHL具有成为安全、低毒的体内靶向给药递送系统的潜力。

用载体CHL荷载不易入胞的药物，并将其递送入细胞，说明CHL可以增加细胞对药物的摄取。在两种高表达IDO的乳腺癌细胞中进行犬尿氨酸生成抑制实验，结果表明入胞后的药物依然可以抑制犬尿氨酸生成，说明经载体递送入胞后的NLG919仍具有抑制IDO的能力，这一结果同前期文献研究结果一致[3]。

综上所述，包载NLG919的乳腺癌靶向纳米载体有望成为一种理想的免疫检查点阻断治疗制剂，后期将开展体外细胞学评价及体内的靶向性、药效学评价，并进一步研究其抗肿瘤作用的机制。