基于荧光光谱探讨“附子性毒，得甘草后解”的机制*

河北医科大学药学院

史梦召 马小宁△ 杨宏超 窦玉红△△ 黄 芸 崔力剑△△ (石家庄 050017)

提要 目的：采用荧光光谱研究甘草有效成分对乌头碱与人血清白蛋白(HSA)相互作用的影响，对“附子性毒，得甘草后解”做出合理解释。方法：在模拟人体血液离子强度和酸碱度条件下，通过荧光光谱等技术，获得乌头碱与HSA相互作用的物理常数，并进一步确定甘草中5种成分对这些物理参数的影响。结果：乌头碱与HSA按照1∶1的比例关系自发形成结合态药物“超分子”。在生理条件下，甘草中5种成分可降低乌头碱与HSA的结合程度。结论：甘草通过减少血液中“结合态”乌头碱浓度，加速乌头碱代谢排出体外，缩短中毒症状持续时间发挥解毒作用。

附子来源于毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx.)的子根，始载《神农本草经》[1]，性毒列为下品，现为临床常用温里药之一。因具“斩关夺门之气”，取其回阳救逆、补火助阳之功效，尤用于亡阳欲脱等危急病证，为“续命起死之要药”。[2]在临床应用过程中，也表现出较强的毒性，李时珍曰：“乌附毒药，非危重病不用，用之不当，致祸甚速。”现代药理学研究也发现，乌头碱口服 0.2 mg 即可中毒，摄入3～5 mg 可致死。[3]众所周知，在我国传统用药过程中总结出炮制、配伍等多种方法对附子减毒增效，其中《景岳全书·本草正》有“附子之性毒，得甘草而后解”记载。中医典籍《伤寒论》和《金匮要略》中也有19首方剂采用了附子甘草配伍，附子甘草配伍现已成为温阳补中常用药对。周子渝[4]、李文[5]、张序晴[6]等从多角度、多手段对甘草解附子之毒的机理进行了实验研究，但截至目前，未见采用荧光光谱法研究的报道。为此，笔者拟以荧光光谱法为手段，以中药有效成分化学相互影响为切入点，对“附子之性毒，得甘草而后解”进行了相关研究。

1 材料与仪器

甘草酸二钾(批号：100551-201802)、甘草次酸(批号：110723-201715)、甘草苷(批号：111610-201607)购自中国食品药品检定研究院；乌头碱(批号：0150-0025，≥98.0%)、甘草素(批号：1073-0025，≥99%)、异甘草苷(批号：0234-0025，≥98.0%)购自成都普思生物科技股份有限公司；人血清白蛋白(HSA)、Tris购自Sigma公司；其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

LS50B荧光光谱仪(美国PE公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用)；PHS-3C数字酸度计(杭州东星仪器设备厂)；CU600电热恒温水浴箱(上海一恒公司)；ME204E分析天平(德国 Sartorims公司)；Milli超纯水机(美国Thermo公司)。

2 方法与结果

2.1 乌头碱与HSA作用的荧光光谱

移取3.0 mL 1.0×10-6mol/L HSA溶液(用pH=7.4，0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制，且内含0.1 mol/L的NaCl维持溶液离子强度)于石英比色皿中，测定其发射光谱，然后用微量进样器逐次加入乌头碱溶液，混匀后用恒温水箱控温298 K、310 K充分反应后，分别测定其发射光谱，激发波长为280 nm，绘制HSA的荧光光谱(见图1)。

注：C乌头碱1→8：0、0.33、0.67、1.00、1.33、1.67、2.00、2.33×10-5mol/L。

图1 乌头碱与HSA作用的荧光光谱(310 K)

如图1所示，固定HSA的浓度，随着体系中乌头碱浓度增加，HSA的内源荧光有规律地产生猝灭，且乌头碱使HSA的荧光发射峰产生一定程度的蓝移，且蓝移程度随温度的升高而增大，证明加入乌头碱后HSA分子构象发生一定程度的变构，导致发射荧光的色氨酸残基微环境的疏水性增强，[7]这说明乌头碱可以和HSA发生了相互作用，形成“超分子”物质。

2.2 乌头碱与HSA作用的同步荧光光谱

溶液配制方法同2.1，控制温度在310 K，固定激发和发射波长间隔Δλ为60 nm，绘制250～320 nm范围内的光谱曲线。实验结果表明，随着乌头碱浓度增加，HSA的荧光强度逐渐降低。乌头碱引起了色氨酸残基发射峰较为明显的蓝移，这也表明乌头碱与HSA发生了相互作用，HSA分子构象变得更加紧密，分子中的“沟”收缩，“沟”中的色氨酸残基所处环境的极性减弱。[8]见图2。

2.3 作用力类型及结合距离

使用热力学方程，[8]对荧光光谱所得数据进行处理，则乌头碱与HSA结合过程的热力学参数为：ΔH=46.58kJ/mol，ΔS298K=235.70J/mol·K-1，ΔS310K=235.71J/mol·K-1，ΔG310K=-23.66kJ/mol，ΔG310K=-26.49kJ/mol，证明二者间的作用力主要为疏水作用力，且结合作用属于自发进行过程。采用Föster's方程，[7]结合紫外光谱对所获荧光数据进行处理，计算得出乌头碱与HSA之间的结合距离分别为r乌头碱=5.089 nm，说明二者作用形成了“超分子”物质。

注：C乌头碱1→7：0、0.33、0.67、1.00、1.33、1.67、2.00×10-5mol/L。
图2 乌头碱与HSA作用的同步荧光光谱(310 K)

2.4结合常数和结合位点数

采用修正的Scatchard方程：lg[(F0-F)/F]=lgKa+ nlg[Q]对所得荧光光谱数据进行处理，即得出289 K和310 K温度下的结合位点数n和结合常数Ka。结果为289 K时Ka=5.110 ×103L/mol，n= 0.903 2，310 K时Ka=6.871×105L/mol，n=1.300 8。由结果可以看出，乌头碱与HSA的结合位点数均接近于1，说明在实验浓度范围内都是近似以1∶1结合。当温度升高时，Ka随之升高，说明温度升高增加了分子间有效碰撞的数目，加剧了电子转移，增强了乌头碱分子与HSA之间的相互作用，这与动态猝灭机制相符合。[8]

2.5 甘草中5种成分对乌头碱与HSA结合的影响

研究甘草中5种有效成分加入后，乌头碱与HSA结合常数及结合位点数的变化。在HSA加入乌头碱之前，在HSA溶液中加入一定浓度(1.00×10-5mol/L)的甘草有效成分, 摇匀静置，待反应平衡后，加入一定量的乌头碱溶液，测定HSA体系的荧光强度。采用修正的Scatchard方程[8]计算乌头碱与HSA的结合常数Ka和结合位点数n(详见表1)。由结果可以看出，甘草中有效成分可使乌头碱与HSA结合常数降低约99%～86%，结合位点数降低约37%～11%，血液中游离乌头碱浓度增加，结合型乌头碱的量大大降低。

表1 甘草中活性成分对乌头碱与HSA结合的影响(310 K)

3 讨论

自西汉以来，附子之毒性记载于多部医典中，《名医别录》、《开宝本草》、《汤液本草》、《本草崇原》等医书中均记载附子“有大毒”，使用不当可导致“痈毒顿生，烂五脏”之弊病。同时《本草新编》等典籍进一步指出“附子之妙，正取其毒也”“以毒制毒，而毒不留”，可见中药附子中的毒性成分也是其有效成分。历代通过多种方法对附子减毒增效，其中采用甘草解附子之毒是较广泛的观点之一，也有多首方剂具体应用。

本研究中，笔者以活性成分的相互作用为基础，采用荧光分析法，通过体外药理实验对“附子之性毒，得甘草而后解”做出合理解释。乌头碱在血液中通过疏水力与血浆白蛋白结合，形成“超分子”(即结合态药物)将部分乌头碱暂时储存在血液中。当附子、甘草同服后，甘草有效成分亦被吸收进入血液，在正常体温(37℃)条件下，甘草中5种(甘草素、甘草酸、甘草次酸、甘草苷、异甘草苷)有效成分通过影响HSA构象，大大降低乌头碱与HSA结合程度，使血浆游离型乌头碱浓度增加，游离型乌头碱在血液中半衰期较短，[9]这样可以加快乌头碱代谢排出体外，从而缩短中毒症状持续时间。同时，甘草苷通过降低心肌细胞内钙浓度保护乌头碱所导致的心肌损伤[10]，甘草酸、甘草次酸等皂苷类成分发挥抗休克等肾上腺皮质激素样作用[11]，均可提升肌体对乌头碱毒性的耐受性。这充分说明祖国传统医学中采用甘草解附子之毒的科学性、合理性，为今后附子与甘草临床配伍应用提供了一定的理论依据。