车前子对腹泻大鼠小肠黏膜AQP1表达的影响*

河北中医学院药学院

王 杨 彪雅宁 张纳博 韩 雪 胡巍巍△ 张一昕 相聪坤△△ 李博妍(石家庄 050200)

提要 目的：研究车前子对腹泻大鼠小肠组织中水通道蛋白1(AQP1)基因和蛋白表达的影响，探讨其治疗腹泻的作用机制。方法：采用番泻叶灌胃复制大鼠腹泻模型。将60只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性药(氢氯噻嗪)对照组和车前子低、中、高剂量组。除正常组外，其余各组均于每日上午灌胃番泻叶水煎液，正常组灌胃等量的蒸馏水；每日下午各治疗组灌服相应的治疗药物，正常组和模型组灌服等量的蒸馏水，给药期间观察大鼠的排便情况，给药2周。麻醉状态下，剖取2份小肠组织，1份置于4%多聚甲醛液中固定，苏木精-伊红(HE)染色法观察小肠黏膜病理形态学变化，1份置于冻存管，液氮冻存，用于qRT-PCR法和Western blot法检测小肠组织AQP1基因和蛋白的表达水平。结果：模型组大鼠排水样稀便；小肠绒毛表皮细胞明显凋亡与坏死，固有层毛细血管扩张充血明显，间质有少量中性粒细胞浸润；小肠组织AQP1基因和蛋白的表达水平均明显低于正常组(P<0.01)。与模型组比较，车前子各剂量组大鼠粪便基本成形；小肠绒毛表皮细胞凋亡、坏死和毛细血管扩张充血现象均减轻，间质有少量中性粒细胞浸润，中、高剂量组可见上皮细胞增生；车前子各剂量组小肠组织AQP1的基因和蛋白的表达水平显著高于模型组(P<0.05或P<0.01)，高剂量组高于阳性药组(P<0.05)。结论：车前子具有止泻作用，其机制与上调AQP1的表达水平，增加小肠对水的吸收量、促进水液代谢有关。

腹泻是多种因素引起胃肠功能出现障碍，以肠道水液代谢紊乱为主要表现的疾病。[1-2]在肠道上皮和内皮组织细胞膜上广泛分布着水通道蛋白(AQPs)，它们在调节水液代谢中起重要作用，与腹泻的发生发展具有密切的关系。[3]车前子(PlantagoasiaticaL.)是车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟种子，归肾、小肠等经，能利小便以实大便而奏止泻之效，单用或随证配伍用于治疗急慢性腹泻具有较好的疗效。[4-5]但尚未发现对其止泻作用机制的研究报道。故本实验采用番泻叶建立大鼠腹泻模型，通过观察车前子对腹泻大鼠小肠组织水通道蛋白1(AQP1)的基因和蛋白的表达的影响，探讨车前子治疗腹泻的作用靶点和机制，为车前子止泻的临床应用提供现代依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠60只，雄性，6～8周龄，体质量160～180 g，购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 实验药物

车前子配方颗粒(批号：8122593，当量比为15∶1)购于四川新绿色药业有限公司，将车前子配方颗粒加入到100℃适量的蒸馏水中，加热充分搅拌使其全部溶解。氢氯噻嗪片(批号：180922)购于山东仁和堂药业有限公司，实验时加入0.5%的羧甲基纤维素钠助溶，配制成所需浓度的混悬液。番泻叶购于石家庄同仁堂药房，称取200 g番泻叶浸入1 000 mL 100 ℃纯净水中，充分搅拌，浸渍30 min后用4层纱布过滤，滤液蒸发浓缩至600 mL，制成番泻叶药液(含生药0.3 g/mL)，置4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.3 实验试剂与仪器

Trizol(批号：139603)购于美国invitrogen生命技术有限公司；TIANScript RT KIT(批号：KR104-02)、SuperReal PreMix Plus(批号：FP205)均购于中国北京天根生化科技有限公司；AQP1兔多抗(货号：bs-1506R-1)购于美国Origene公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。三恒多用电泳仪(15D型，北京六一生物科技公司)；紫外透射仪(uv-254型，北京鼎国昌盛生物有限责任公司)；凝胶成像系统(UVP型，中国Thermo公司)；半干转膜仪系统(AE-6687型，日本ATTO公司)；TS-500转移脱色摇床、QL-902涡旋混合器(中国海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；ABI7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Centrifuge 5415D离心机、BioPhotometer生物分光光度计(德国Eppendorf公司)。

1.4 动物分组及模型建立

将60只SD大鼠饲养于18 ℃～22 ℃明暗各12 h的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为6组：正常对照组、模型对照组、阳性药(氢氯噻嗪)对照组(9 mg/kg)和车前子低、中、高剂量组(0.69、1.38、2.76 g/kg)，每组10只。除正常组外，其余各组均于每日上午灌胃番泻叶水煎液(20 mL/kg)，复制大鼠腹泻模型，正常组灌胃等量的蒸馏水做对照；每日下午各治疗组灌服相应的治疗药物，正常组和模型组灌服等量的蒸馏水，给药体积为1 mL/100 g，给药2周。给药期间观察大鼠排便情况。

1.5 标本采集

给药结束禁食16 h后，3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉状态下，迅速取2份小肠组织，剖开，生理盐水冲洗干净后，1份置于4%多聚甲醛液中固定，用于观察小肠黏膜病理形态学变化，另1份置于冻存管，液氮冻存，用于检测AQP1的基因和蛋白的表达水平。

1.6 病理学观察

将4%多聚甲醛固定的小肠组织取出，采取常规的脱水、浸蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察其病理学改变情况。

1.7 qRT-PCR方法观察小肠组织中AQP1 mRNA表达水平

取冻存的小肠组织，Trizol提取其总RNA，取用5 μL RNA，1%琼脂糖凝胶进行电泳，目的是检测RNA的完整性。primer5.0软件设计实验所需各引物序列。内参基因β-actin：F/R 5 '-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA -3'，5'-GGAAGGAAGGCTGGAAGA -3 '，扩增片段为140 bp。AQP1：F/R 5'-GGCTTGTCTGTGGCTCTTGGAC-3'，5'-AGTGGTTTGAGAAGTTGCGGGT-3',扩增片段为112 bp。依据产品的说明书采用TIANScript RT KIT进行反转录操作，运用荧光定量PCR仪，按照相对定量方法分析，以2-△△Ct表示基因的相对表达量。

1.8 Western blot法观察小肠组织中AQP1蛋白的表达水平

称取小肠组织约100 mg，液氮充分研磨后，转移到含有1 mmol/L PMSF的900 μLRIPA的中性裂解液中，混合均匀之后超声裂解，配平以后在4 ℃温度下，离心机转速12 000 r/min，离心15 min静置后，收集其上清液测定蛋白含量，将蛋白煮沸变性以后，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，再转移到PVDF膜上，其后用5%的脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，洗净未结合的一抗。将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中，室温孵育1.5 h，PBST洗膜3次，洗去游离二抗。暗室曝光，X胶片上显影，用Tanon Gis软件扫描各条带的吸光度值并分析结果。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 实验大鼠粪便变化情况

除正常组以外，其余大鼠灌饲番泻叶药液2 d后，排出夹杂黏液的水样稀便，腹泻发生率为100%，同时大鼠出现不同程度的食欲减少，精神差，活动减少，毛发干枯失去光泽，肛周体毛被稀便沾染。给药4 d后，各用药组大鼠粪便逐渐成形，含水量降低，但车前子各剂量组与阳性药组相比，大便仍偏于湿软。

2.2 实验大鼠小肠黏膜病理形态学变化

正常组大鼠小肠绒毛表皮较完整，细胞排列整齐，但有少量表皮细胞凋亡与坏死脱落；模型组大鼠小肠绒毛表皮细胞出现明显凋亡与坏死，固有层毛细血管扩张充血明显，间质有少量中性粒细胞浸润；阳性药组大鼠小肠绒毛表皮细胞少数凋亡与坏死，固有层毛细血管扩张充血明显，偶见中性粒细胞浸润；车前子低、中剂量组大鼠小肠绒毛上皮细胞凋亡、坏死以及固有层充血减轻，中性粒细胞浸润多见，中剂量组可见上皮细胞增生活跃，核分裂明显；车前子高剂量组大鼠小肠绒毛上皮细胞凋亡少见，上皮细胞轻微增生，排列较密集，固有层轻微充血和少量的中性粒细胞浸润。见图1。

注：A 正常组；B 模型组；C 阳性药组；D 低剂量组；E 中剂量组；F 高剂量组。

2.3 实验大鼠小肠组织AQP1 mRNA和蛋白的表达变化

与正常组比，模型组AQP1 mRNA和蛋白的表达水平均表现为明显的下降(P<0.01)；与模型组比，各用药组AQP1 mRNA和AQP1蛋白的表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与阳性药组比，高剂量组明显升高(P<0.05)。详见表1、图2。

3 讨论

中医将腹泻归属于“泄泻”范畴，认为肌体由于外邪侵袭，或被饮食所伤，导致脾失健运，水液运输发生障碍，水湿停聚于肠中而引起以排便次数增多、粪便稀溏，甚至如水样的症状。正如 《景岳全书·泄泻》所说：“凡泄泻之病，多由水谷不分，故以利水为上策。”因此，治疗腹泻常选用利小便的药物。车前子为利水渗湿的常用药，历代医家每每用其良好的通利小便作用，达到“利小便以实大便”的目的，临床单用或随证配伍治疗湿热泄泻(急性肠炎)、脾虚湿盛的慢性泄泻等多种原因导致的腹泻。

表1 各组大鼠小肠组织AQP1 mRNA和AQP1蛋白表达水平的比较

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05， △△P<0.01；与高剂量组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与阳性药组比较，﹟P<0.05。

注：1 正常组；2 模型组；3 阳性药组；4 低剂量组；5 中剂量组；6 高剂量组。

小肠是调节肌体液体分泌、吸收和转运的主要器官，若因某些因素刺激肠道释放炎性因子、发生炎症反应，进而激活水通道及其转运体的活性改变，致使水分和电解质在肠道吸收、代谢功能紊乱，则会聚集于肠腔出现腹泻。[6]肠道水液的吸收和分泌是通过跨细胞的途径而实现的，而AQPs则是肠道跨途径转运、实现该功能的重要载体，在水液代谢中发挥着重要的作用。[7]AQPs 的表达异常会导致肠道水分吸收减少而大量蓄积诱发腹泻。[3]目前，已有6种AQPs在小肠中被发现，AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8以及AQP9，[8]AQP1在小肠中段表达最为明显。[9-10]据报道，番泻叶能促进肠蠕动，抑制肠道的消化功能，并刺激肠道，促进炎性介质的合成与释放，进而损伤肠黏膜和增加大肠排空速度，造成大鼠腹泻。[11]腹泻时，小肠处于高分泌的状态，会明显升高肠腔内的渗透压。[12]当肠道渗透压升高时，肠道会明显降低对水的吸收量，肌体会代偿性的增加AQPs的表达量，使小肠对水的吸收能力有所提高。[13]逯越[2]等证实番泻叶引起的大鼠腹泻模型中小肠组织AQP1的蛋白表达水平低于正常组，影响小肠对水的代谢吸收功能而引起腹泻，因此AQP1对腹泻的发生发展具有重要的影响。

本实验结果显示模型组大鼠排水样稀便；小肠黏膜中出现柱状上皮细胞凋亡坏死、毛细血管扩张充血以及间质中性粒细胞浸润现象；小肠组织中的AQP1 mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.01)，表明番泻叶导致小肠黏膜出现较为明显的炎症性改变，部分小肠黏膜细胞出现凋亡和坏死，小肠组织AQP1 mRNA和蛋白的表达显著下降，水分吸收减少而在肠道大量聚集出现腹泻。经给予车前子治疗后，大鼠粪便基本成形；小肠黏膜柱状上皮细胞凋亡坏死、毛细血管扩张充血以及间质中性粒细胞浸润现象均减轻；伴随着小肠黏膜炎症反应的减轻和好转，小肠组织AQP1 mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.01)，肠道对水分吸收增加，肠腔中水分减少，粪便逐渐成形，腹泻明显减轻。由此可见，车前子通过减轻番泻叶所致小肠黏膜的炎症反应，上调AQP1 mRNA和蛋白的表达水平，促进水分吸收和转运速度，调节水液代谢，以达到治疗腹泻的目的，此可作为车前子治疗腹泻的机制之一。