汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响

陈琳吕炎何文龙胡晶范婧莹何迎春，

作者单位：410208长沙1湖南中医药大学医学院；2湖南中医药大学研究生院；3中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室；4湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心

我国鼻咽癌发病率和死亡率均高于全球平均水平［1］。放疗或同步放化疗是鼻咽癌主要的治疗手段［2］。早期鼻咽癌治疗效果较好，但晚期复发、转移患者疗效不理想，因此亟需寻找鼻咽癌效的治疗药物［3］。研究表明中药在鼻咽癌治疗中可取得一定的效果［4-5］。汉黄芩素是从黄芩干燥根茎中提取的一种黄酮类化合物，有抗癌、利尿作用，可通过多种途径抗肿瘤活性［6］。体外抗鼻咽癌实验发现汉黄芩素可通过作用于蛋白GSK-3beta和DeltaNp63抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［4］，但具体的作用机制未明确。本研究采用不同浓度汉黄芩素作用鼻咽癌CNE2细胞，观察其对细胞增殖、调亡的影响及并初步探讨可能的作用机制，为汉黄芩素用于鼻咽癌治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

鼻咽癌CNE2细胞购自北京协和细胞库，由本实验室传代培养。汉黄芩素购自上海金穗生物科技有限公司。胎牛血清购自Gibco公司，Bcl-2、Bax抗体购自美国Abcam公司，一抗Survivin、XIAP、β-actin、PCNA购自美国CST公司，荧光二抗（鼠抗、兔抗）购自赛默飞世尔科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司，荧光双染流式细胞仪Cellometer Image Cytometer（K2）购自Nexcelom公司，实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物科技公司；多功能荧光成像Odyssey CLx购自Gene有限公司。

1.2 鼻咽癌CNE2细胞培养与分组

鼻咽癌CNE2细胞用含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L链霉素的RPMI-1640培养基培养于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱。取对数生长期细胞用于后续实验。用DMSO溶解汉黄芩素粉末制成母液，分装后避光冻存于-80℃冰箱。实验分为不同浓度（2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L）汉黄芩素组和溶剂对照组（加入DMSO溶解母液）。

1.3 实时无标记细胞功能分析仪监测细胞增殖情况

将50μL培养液加入专用板，放入仪器，每孔初始值相同。取出板子向每孔加入200μL单细胞悬液（4×103/孔），实时监测细胞增殖情况。当细胞指数（cell index，CI）达到1.0时，暂停监测，取出板子，吸出200 mL培养液，再向每孔加入200μL液体，每组3个复孔。按顺序放入实时监测仪监测。以CI值表示细胞增殖情况，CI计算公式：CI=（Rn-Rb）/15。用实时无标记细胞功能分析仪绘制不同药物浓度及时间作用下的细胞增殖动态曲线图。结合IC50值决定汉黄芩素的作用时间和浓度，进行后续流式细胞术和Western blot实验。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况

将细胞消化重悬后接种于培养皿，处于对数生长期CNE2细胞并分别用10.0μmol/L、20.0μmol/L汉黄芩素作用，同时设溶剂对照组。48 h后收集细胞，再加入2 mL PBS，1 000 r/min离心10 min，吸取上清液。重复离心3次，加入Annexin-V FITC和PI混合液，避光染色15 min，用移液枪将细胞悬液混匀，吸取20μL细胞悬液加入流式细胞术专用板，用荧光双染流式细胞仪检测，计算每组细胞凋亡率，实验重复3次。

1.5 Western blot实验检测蛋白表达

处理各组细胞48 h后，PBS清洗3次，冰上裂解40 min后提取总蛋白，用BCA定量法定量，恒流电泳、恒压转膜、脱脂牛奶封闭后分别加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗脱后加入荧光二抗（鼠抗用于β-actin，兔抗用于其余蛋白），室温避光孵育2 h，洗脱后以多功能荧光成像系统Odyssey CLx显影蛋白条带。以β-actin为内参，各蛋白相对表达量=各蛋白条带灰度值/β-actin的灰度值。实验重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件分析数据，组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步的多重比较采用Dunnett-t检验（以对照组为参照）。以α=0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响

2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L汉黄芩素作用鼻咽癌CNE2细胞24 h后，细胞增殖抑制率分别为20.3%、23.7%、33.4%、40.9%，IC50值为42.41μmol/L；36 h后细胞增殖抑制率分别为18.0%、22.0%、36.1%、40.5%，IC50值为34.46μmol/L；48 h后细胞增殖抑制率分别为7.4%、20.2%、35.0%、40.9%，IC50值为22.81μmol/L，细胞生长曲线见图1。

图1 不同浓度汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of Wogonin on proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells

2.2 汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响

10.0μmol/L、20.0μmol/L汉黄芩素处理鼻咽癌CNE2细胞48 h后，细胞凋亡率分别为（17.92±0.93）%和（20.56±0.59）%，对照组细胞凋亡率均为（5.10±0.14）%，与对照组比较，差异均有统计学意义（t=23.710，P=0.001；t=43.934，P＜0.001）。见图2。

2.3 汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

10.0μmol/L和20.0μmol/L汉黄芩素处理鼻咽癌CNE2细胞48 h后，与对照组比较，20.0μmol/L汉黄芩素作用的鼻咽癌CNE2细胞中细胞增殖相关蛋白PCNA表达量降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；抗凋亡相关蛋白Survivin、XIAP的表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；见图3A；10.0μmol/L和20.0μmol/L汉黄芩素作用时抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达均降低（P＜0.05），而促凋亡蛋白Bax表达升高（P＜0.05），见图3B。

图2 不同浓度汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of different concentrations of Wogonin on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells

图3 汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响Fig.3 Effects of Wogonin on proliferation-and apoptosis-related protein expression of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells

3 讨论

研究发现汉黄芩具有良好的抗肿瘤作用［7-8］。在人肝癌细胞中汉黄芩素可通过抑制MMP-9表达而抑制癌细胞迁移和侵袭［9］，亦可影响卵巢癌细胞增殖［6］。在鼻咽癌中发现汉黄芩素可通过Akt途径诱导癌细胞自噬和凋亡，具有增殖抑制作用［10］。本研究发现不同浓度汉黄芩素在48 h内均可抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖，且细胞增殖抑制率随浓度和作用时间增加而增大。汉黄芩素作用CNE2细胞48 h时，细胞增殖抑制率与24 h、36 h相当，但IC50值（22.81μmol/L）明显小于24 h、36 h，因此选择10.0μmol/L和20.0μmol/L汉黄芩素作用48 h为实验条件，进一步行流式细胞术观察汉黄芩素对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响，结果发现2个浓度药物均可诱导细胞凋亡，说明汉黄芩素能抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖，诱导细胞凋亡。

PCNA是一种DNA聚合酶辅助蛋白，可促进DNA复制与修复，促使肿瘤细胞增殖［11］。有研究报道PCNA表达与鼻咽癌颈部淋巴结转移有关［12］。Survivin是抗凋亡蛋白家族中最小的成员，具有抗凋亡及促进增殖作用，且表达于多条维持肿瘤存活的信号传导通路。在体外抗鼻咽癌CNE2细胞实验中发现沉默Survivin基因可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡［13-14］。XIAP也是一种抗凋亡蛋白，多项研究发现其可增强S18鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力［15-17］。Bcl-2蛋白是原癌基因Bcl-2的表达产物，具有抗细胞凋亡作用，在鼻咽癌中表达阳性率可达80%。Bax是凋亡蛋白家族的一员，可通过与Bcl-2竞争而调控细胞凋亡，在竞争过程形成的同源二聚体（Bax/Bax）可通过线粒体途径诱导细胞凋亡，而异源二聚体（Bax/Bcl-2）是细胞生存信号之一［18-19］。研究发现上调Bax/Bcl-2比例可促进鼻咽癌6-10B细胞恶性增殖，抑制细胞凋亡［20］。阿司匹林亦可通过降低Bcl-2表达水平和提高Bax表达水平而诱导细胞凋亡［21］。综上可见，鼻咽癌细胞增殖及凋亡与增殖和凋亡相关蛋白的表达密切相关。因此，本研究在10.0μmol/L、20.0μmol/L汉黄芩素作用的鼻咽癌CNE2细胞中观察增殖相关蛋白PCNA、抗凋亡相关蛋白Survivin、XIAP、Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax的表达情况，结果亦发现20.0μmol/L汉黄芩素能显著抑制Survivin、XIAP表达，但10.0μmol/L汉黄芩素作用影响不明显；在10.0μmol/L和20.0μmol/L汉黄芩素作用下，促凋亡蛋白Bax表达量均显著升高，而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显降低，即Bcl-2/Bax比值大幅下调，提示汉黄芩素可能通过下调抗调亡相关蛋白及上调促凋亡蛋白而抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖，诱导细胞凋亡。

本研究发现，汉黄芩素可能通过抑制Survivin、XIAP、Bcl-2表达并促进Bax表达而发挥抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖并诱导细胞凋亡作用，但具体通过何种细胞信号通路调控有待进一步研究，且仅观察汉黄芩素在体外对鼻咽癌CNE2细胞株的作用，汉黄芩素在体内及对其他鼻咽癌细胞株的作用亦有待进一步研究。