不同炮制方法对黄芩活性成份含量及抗氧化作用的影响

高可新，李利霞，王小康

(焦作市中医院 1 中药剂科，2 药学部，焦作 454150)

黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，味苦性寒，具有清热燥湿、泻火解毒和止血安胎的功效[1]。临床应用有生黄芩及其炮制品，如蒸黄芩、煮黄芩、姜黄芩、蜜黄芩、炒黄芩、酒黄芩和黄芩炭等，其中以酒黄芩临床应用较多。生黄芩清热泻火解毒力强，善于治疗热病、湿温黄疸、湿热泻痢及乳痈发背等。酒黄芩入血分，酒炙能引药上行，缓和生黄芩的寒性，增强清上焦肺热的功效。

黄酮类化合物是黄芩的主要活性物质，代表成份为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷以及汉黄芩素等。研究表明[2-3]，黄芩中黄酮类化合物具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保肝利胆、抗菌消炎和抗过敏作用，以及对免疫系统、消化系统和神经系统等的保护作用。

本研究以黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷以及汉黄芩素含量和抗氧化作用为指标，考察不同炮制方法对黄芩活性成份及抗氧化作用的影响，从化学和生物药理学角度探索黄芩炮制原理。现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；DAD检测器(美国Agilent公司)；UV755B型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；FW100型万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；XS205型分析天平(Mettler Toledo公司)等。

1.2 试药

黄芩苷(批号：110715-201821，纯度：95.4%)、黄芩素(批号：111595-201808，纯度：97.9%)、汉黄芩素(批号：111514-201706，纯度：96.8%)以及汉黄芩苷(批号：112002-201702，纯度：98.5%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。

2 研究方法

2.1 黄芩的炮制

本研究所用黄芩原药材采购于河北蔺氏盛泰药业有限公司(批号：1909051132)，经张志俭主任鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。黄芩炮制品的制备均按《中国药典》2020年版“0213 炮制通则”[4]自行炮制。

生黄芩：取黄芩药材，除去杂质，置沸水中煮10 min，取出，闷透，切薄片，干燥。

酒黄芩：取生黄芩片，每1000 g生黄芩片，加黄酒120 g拌匀，闷透，用文火炒至表面呈微黄色，取出，放凉。

2.2 活性成份的检测

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷10.432 mg、黄芩素2.646 mg、汉黄芩苷2.715 mg、汉黄芩素2.385 mg，于10 ml棕色量瓶中，用适量甲醇溶解并定容，制得混合对照品储备液。将混合对照品储备液分别稀释2、4、6、8、16倍，制成不同浓度的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

称取生黄芩和酒黄芩各100 g，用万能粉碎机粉碎，过3号筛，备用。精密称取生黄芩和酒黄芩粉末各0.3 g，分别加入40 ml 70%乙醇，回流提取2次，每次1 h，合并滤液，70%乙醇定容至100 ml，混匀。经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，制成供试品溶液，平行试验3次。

2.2.3色谱条件

Polaris C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，进样体积20 μl，检测波长275 nm。洗脱条件：0～5 min，25%B；5～15 min，25%→55%B；15～22 min，55%B；22～23 min，55%→25%B；23～30 min，25%B。

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1DPPH清除率

取生黄芩和酒黄芩的供试品溶液各1 ml，分别加入3 ml 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀后，乙醇定容至10 ml，避光处反应30 min后，在517 nm处测定吸光值。以纯化水作为空白对照，0.1 mg/ml抗坏血酸作为阳性对照，计算DPPH清除率。IC50表示对自由基的抑制率为50%时的试样溶液浓度。将待测抗氧化剂配制成系列溶液，测定各浓度抗氧化剂对DPPH的清除率，在清除率20%～80%范围内，绘制清除率-浓度曲线，计算出清除率为50%时的浓度值，即为IC50值。

2.3.2·OH清除率

取生黄芩和酒黄芩的供试品溶液各1 ml，分别加入0.1 ml 10 mmol/L FeSO4·7 H2O、0.1 ml 10 mmol/L EDTA、0.5 ml 10 mmol/L 2-D-脱氧核糖溶液和0.9 ml 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)；混匀后，加入0.2 ml 10 mmol/L H2O2；37 ℃水浴60 min后，用1.0 ml 2.8% TCA终止反应；加入1.0 ml 1.0%硫代巴比妥酸，沸水浴15 min；取出冷却后，在532 nm处测定吸光值。以磷酸盐缓冲液(pH 7.4)作为空白对照，0.1 mg/ml抗坏血酸作为阳性对照，计算·OH清除率和IC50值。计算公式同“2.3.1”项下公式。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1线性与范围

以各成份对照品的质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，作线性回归方程。结果：黄芩苷y=11.72x+175.62(r2=0.9994)，线性范围为65.20～1043.20 μg/ml；黄芩素y=17.96x-86.29(r2=0.9997)，线性范围为16.54～264.60 μg/ml；汉黄芩苷y=17.55x+10.39(r2=0.9995)，线性范围为16.97～271.50 μg/ml；汉黄芩素y=8.14x-42.34(r2=0.9993)，线性范围为14.91～238.50 μg/ml。

3.1.2精密度试验

取酒黄芩样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱方法连续进样6次。记录黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积。结果：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积RSD分别为0.75%、0.80%、0.96%和0.76%，表明仪器精密度良好。

3.1.3重复性试验

取酒黄芩样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱方法依次进样分析，记录黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积。结果：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积RSD分别为1.15%、1.33%、1.30%和1.84%，表明该方法重复性良好。

3.1.4稳定性试验

取酒黄芩样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱方法立即进样分析，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素不同时间峰面积。结果：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素峰面积RSD分别为0.28%、0.83%、0.34%和0.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.1.5回收率试验

取酒黄芩样品0.15 g，精密加入各适量对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱方法进样分析，根据检测量和加入量计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素的加样回收率。结果见表1，表明各检测指标回收率良好。

表1 加样回收率结果n=6，%

3.2 活性成份含量测定

本研究对生黄芩和酒黄芩中4种黄酮类成份进行测定。结果：酒黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷含量低于生黄芩、黄芩素和汉黄芩素含量高于生黄芩(P<0.05)。见表2。

表2 生黄芩和酒黄芩的活性成份含量测定

3.3 抗氧化作用

表3 生黄芩和酒黄芩的抗氧化作用

4 讨论与结论

中药的炮制有重要意义，表现为去掉非药用部位、泥沙、灰尘等杂质；便于粉碎和制剂；矫正不良气味；降低毒性、减少毒副作用、缓和刺激性；改变药物性能；增加药物疗效；引药归经等。黄芩为我国的大宗药材之一，味苦性寒，泻火力强，临床应用前常需炮制。中医认为“酒炙则升”，生黄芩经酒炙后，可引药上行，属于“相反为制”范畴。酒黄芩可借酒的升腾之力，作用于上焦及头面部，有利于清上焦肺热和四肢肤表之湿热，又因酒性大热，可缓解黄芩苦寒之性，减少对脾阳的损伤[5]。

目前从黄芩中分离得到的成份多达40种，主要包括黄酮类、苯甲酸、多糖、氨基酸以及微量元素等。其中，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素可作为黄芩药材及其有关制剂的质控指标[6]。黄芩在炮制后，化学成份会发生一定程度的变化。本研究对生黄芩和酒黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素进行测定。结果显示，酒黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷含量低于生黄芩，黄芩素和汉黄芩素含量高于生黄芩(P<0.05)。分析原因：可能与黄芩药材中的酶类物质及水解作用有关。生黄芩中的酶可促进黄芩苷和汉黄芩苷转化为黄芩素和汉黄芩素，经过高温灭活，可杀酶保苷，但高热也可能会引起黄芩苷和汉黄芩苷的分解，使含量降低。黄芩素、汉黄芩素含量的升高，说明酒炙后黄芩苷和汉黄芩苷被分解为苷元，且分解作用大于杀酶保苷作用。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)在生物体中有非常重要的信号传导作用，其含量过高时可引起线粒体的氧化应激反应，损伤脂类、蛋白质和核酸等细胞大分子物质，进而引起癌症、心血管疾病以及神经退行性疾病等严重疾病的发生[7]。抗氧化剂是维持生命健康的主要物质，可有效减慢或抑制过量自由基对机体的损伤，降低重大疾病发病率。现有的抗氧化剂包括人工合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。人工合成抗氧化剂存在多种不良反应，可能会对肝、脾、肺等器官造成损伤；天然抗氧化剂源自植物，相对更加安全有效，具有较强的发展潜力。

综上所述，生黄芩经酒炙后黄芩苷和汉黄芩苷含量降低，黄芩素和汉黄芩素含量升高，抗氧化作用增加。