高脂饮食对结肠癌肝脏转移的影响及作用机制

郭世奎张剑李锦媛包维民张鹏黄映光凌平王勇志赵泉

作者单位：650032昆明 1云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院普外一科；650500昆明 2昆明理工大学医学院

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率和死亡率在全球恶性肿瘤中均位于前三位［1］。临床数据表明，肿瘤转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，其中肝脏是最常见的转移靶器官［2］。流行病学数据显示，肥胖导致的慢性低度炎症、胰岛素抵抗、脂肪来源激素失衡和肠道微生物群等均是已知的促进结肠癌发病的因素［3］，而高脂饮食可直接或通过诱导肥胖增加结直肠癌发病风险［4］。也有研究发现高脂饮食可通过诱导上调结肠癌中K-Hcy的表达而抑制DNA损伤修复，从而促进结肠癌发展［5］。然而高脂饮食能否促进结肠癌肝脏转移及其作用机制仍未知。基质细胞衍生因子-l（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是CXC趋化因子家族成员，通过结合并激活受体CXCR4而参与调控乳腺癌转移［6-7］。近年在结直肠癌研究中亦发现CXCR4高表达可促进肿瘤细胞淋巴结和远端转移［8-10］。本研究通过建立高脂饮食的结肠癌裸鼠移植瘤模型，探讨高脂饮食对结肠癌肝脏转移的影响及其是否通过SDF-1/CXCR4信号通路发挥作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人结肠癌细胞系DLD1购自中国科学院上海细胞所，用含有10%胎牛血清和10μg/mL的青霉素及链霉素的DMEM培养基于5% CO2、37℃恒温条件下培养。30只NSI第三代免疫缺陷裸鼠购自中山大学实验动物中心（许可证号：SCXK〔粤〕2016-0029），雌性，体重18～20 g，4～12周龄。普通饲料和高脂饲料购自上海达燊实业有限公司，高脂饲料主要成分为酪蛋白、L-Cystine胱氨、玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖、纤维素、豆油、猪油、复合矿物质、磷酸氢钙、碳酸钙、柠檬酸钾、复合维生素、酒石酸氢胆碱。CXCR4拮抗剂AMD3100购自Sigma公司；CXCR4和兔抗人单克隆抗体购自Abcam公司；BCA试剂盒、裂解液RIPA购自生工生物工程（上海）股份有限公司；总RNA提取试剂盒（TRIzol法）购自北京百泰克生物技术有限公司；血清瘦素检测试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司；逆转录试剂盒和SYBR Green Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；SDF-1一抗、CXCR4一抗、β-actin一抗和HRP标记的二抗购自杭州华安生物技术有限公司。

1.2 结肠癌裸鼠移植瘤模型的构建及分组

取对数生长期的结肠癌DLD1细胞制成1×107/mL细胞悬液，取100μL细胞悬液注射至裸鼠脾脏下，建立裸鼠移植瘤模型。将30只荷瘤裸鼠随机分成对照组、高脂饮食组和高脂饮食+AMD3100组，每组10只。其中，对照组裸鼠以普通饲料喂养（3 g/次，2次/d）；高脂饮食组裸鼠以高脂饲料喂养（3 g/次，2次/d）；高脂饮食+AMD3100组裸鼠以高脂饲料喂养（3 g/次，2次/d）同时腹腔注射0.1 mmol/L的AMD3100 100μL，每天腹腔注射1次，持续12周。本研究经昆明理工大学附属医院伦理委员会批准。动物实验根据美国国立卫生研究院动物护理和使用指南进行。

1.3 裸鼠基本情况检测

实验期间每隔2 d于同一时间点称量裸鼠体重，12周后以颈椎脱臼方式处死。处死前，采用眼球取血法收集各组裸鼠血液，3 000 r/min离心15 min，收集上层血清；按照血清瘦素检测试剂盒使用说明书测定裸鼠血清瘦素浓度。剥离裸鼠肾周脂肪组织、游离附睾垫脂肪组织和肝脏组织，称量脂肪重量和肝脏重量。收集肝脏组织，进行HE染色，选取不同切面的5个切片，观察各组裸鼠肝脏转移情况；利用游标卡尺测定肿瘤长直径和短直径并计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积=长直径×短直径2/2。

1.4 Western blot检测SDF-1和CXCR4蛋白表达情况

取移植瘤组织（约85mm3）用无菌1×PBS冲洗2次，加入0.5 mL细胞裂解液RIPA，匀浆器切割，室温放置30 min，12 000 r/min离心15 min，收集上清蛋白液。根据BCA试剂盒说明书进行蛋白定量。取100μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入SDF-1、CXCR4一抗，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗，37℃孵育1 h，加入ECL超敏发光液进行X线片曝光，采用Image J软件测定灰度值。以β-actin作为内参蛋白。实验重复3次。

1.5 RT-qPCR检测SDF-1和CXCR4 mRNA表达情况

按照总RNA提取试剂盒说明书（TRIzol法）提取结肠癌组织总RNA，测定RNA浓度和纯度。取上述提取的RNA，用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行RT-qPCR。RT-qPCR按照SYBR Green Master Mix说明书进行，反应体系：qPCR mastermix 10μL，上、下游引物各0.6μL，RNase-Free ddH2O补充至20μL；反应条件：95℃40 s，95℃5 s，60℃30 s。引物序列：SDF-1上游为5'-C CGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3'，下游为5'-CCTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3'；CXCR4上 游为5'-AGCTGTTGGCTGAAAAGGTGGTCTATG-3'，下游为5'-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3'；β-actin上游为5'-CACCAACTGGGACGACATGG-3'，下游为5'-CCAGGGTACATGGTGCC-3'。以β-actin为内参。采用2-△△Ct法计算SDF-1和CXCR4 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.6 统计学方法

采用Graphpad Prism统计软件分析。计数资料采用n（%）表示，比较采用Fisher精确检验；计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饮食对结肠癌移植瘤裸鼠体质的影响

30只NSI第三代免疫缺陷裸鼠脾脏注射结肠癌DLD1细胞5 d后均成瘤，成瘤率100.0%。裸鼠生长状态良好，饮食和饮水无异常。12周后，高脂饮食组裸鼠体重、肝脏重量、脂肪重量和血清瘦素浓度均高于对照组（P＜0.05）。高脂饮食+AMD3100组裸鼠体重、肝脏重量、脂肪重量和血清瘦素浓度则低于高脂饮食组（P＜0.05）。见图1、表1。

2.2 高脂饮食对结肠癌移植瘤裸鼠肝脏转移的影响

对照组、高脂饮食组裸鼠发生肝脏转移的比例分别为30.0%（3/10）、80.0%（8/10），两组比较差异有统计学意义（P=0.035）。高脂饮食组裸鼠的肿瘤体积及肝脏转移灶数量明显高于对照组［（3.83±0.42）mm3vs（1.00±0.15）mm3，P＜0.001；（4.33±0.58）个vs（1.33±0.58）个，P=0.002）］，见图2。

图1 高脂饮食对结肠癌移植瘤裸鼠体质的影响Fig.1 Effect of high-fat diet on constitution of colon cancer xenografts in nude mice

表1 高脂饮食对结肠癌移植瘤裸鼠体质的影响Tab.1 Effect of high-fat diet on constitution of colon cancer xenografts in nude mice

高脂饮食+AMD3100组裸鼠发生肝脏转移的比例为40.0%（8/10），与高脂饮食组比较差异无统计学意义（40.0% vs 80.0%，P=0.085）。高脂饮食+AMD3100组裸鼠的肿瘤体积及肝脏转移灶数量显著低于高脂饮食组［（1.96±0.15）mm3vs（3.83±0.42）mm3，P＜0.001；（2.33±0.58）个vs（4.33±0.58）个，P=0.002）］，见图2。

图2 高脂饮食对结肠癌移植瘤裸鼠肝脏转移的影响Fig.2 Effect of high-fat diet on liver metastasis of colon cancer xenografts in nude mice

2.3 高脂饮食对结肠癌移植瘤组织中SDF-1和CXCR4表达的影响

Western blot和RT-qPCR检测结果显示，高脂饮食组结肠癌移植瘤组织中的SDF-1蛋白和mRNA的表达水平均较对照组上调（2.27±0.21 vs 1.00±0.12，P＜0.001；3.11±0.23 vs 1.00±0.09，P＜0.001），见图3；CXCR4蛋白和mRNA的表达水平亦较对照组上调（2.41±0.26 vs 1.00±0.15，P＜0.001；2.90±0.14 vs 1.00±0.10，P＜0.001），见图4。

高脂饮食+AMD3100组结肠癌移植瘤组织的SDF-1蛋白和mRNA的表达水平分别为1.59±0.12和1.92±0.13，较高脂饮食组比较明显下调（1.59±0.12 vs 2.27±0.21，P=0.009；1.92±0.13 vs 3.11±0.23，P＜0.001），见图3。高脂饮食+AMD3100组结肠癌移植瘤组织中的CXCR4蛋白和mRNA的表达水平分别为1.48±0.08和1.77±0.11，与高脂饮食组比较亦明显下调（1.48±0.08 vs 2.41±0.26，P=0.002；1.77±0.11 vs 2.90±0.14，P＜0.001），见图4。

图3 高脂饮食对结肠癌组织中SDF-1蛋白和mRNA表达的影响Fig.3 Effect of high-fat diet on the protein and mRNA expression of SDF-1 in colon cancer

图4 高脂饮食对结肠癌组织中CXCR4蛋白和mRNA表达的影响Fig.4 Effect of high-fat diet on the protein and mRNA expression of CXCR4 in colon cancer tissues

3 讨论

大量研究报道高脂饮食在结直肠癌的发生过程中扮演重要角色［11-13］。BEYAZ等［14］发现高脂饮食可增强肠道祖细胞的干性和致瘤性，从而促进结直肠瘤发生。肝脏是结肠癌转移的主要靶向器官，然而高脂饮食能否促进结肠癌肝转移还未知。本研究将人结肠癌DLD1细胞接种至裸鼠脾脏构建裸鼠移植瘤模型，建模5 d后30只裸鼠均成瘤，成瘤率100.0%。采用高脂饲料和普通饲料持续喂养荷瘤裸鼠12周后，发现高脂饮食组裸鼠体重、脂肪重量、肝脏重量、血清瘦素浓度均高于对照组，说明高脂饮食调整了移植瘤裸鼠的机体生理状况，有助于肿瘤转移。瘦素在抑制食欲、增加能量消耗、减少能量摄取以及抑制脂肪合成方面发挥调控作用［15-16］。因此，高脂饮食组移植瘤裸鼠血清瘦素浓度增加可能是裸鼠对高脂饮食的负反馈调节，使之恢复正常体重。此外，高脂饮食组移植瘤裸鼠的肿瘤体积、发生肝脏转移的比例及肝脏转移灶数目均明显高于对照组，说明高脂饮食可以促进结肠癌肝脏转移。

有研究发现，SDF-1参与结肠癌转移调控［9］。CXCR4是SDF-1的受体，近年来大量研究发现，CXCR4高表达可促进结直肠癌细胞淋巴结和远端转移［7-9］。研究表明SDF-1/CXCR4轴的激活能促进肿瘤细胞趋化迁移［9，17］，但是高脂饮食在这一过程中的调控作用尚未见报道。本研究结果显示，高脂饮食组裸鼠移植瘤组织中，SDF-1、CXCR4的蛋白和mRNA表达均较对照组明显上调，提示高脂饮食可能通过SDF-1/CXCR4信号通路促进结肠癌肝脏转移。

为进一步验证高脂饮食是否通过SDF-1/CXCR4信号通路促进结肠癌肝脏转移，本研究同时对高脂饮食喂养的移植瘤裸鼠注射AMD3100。AMD3100是一种CXCR4的拮抗剂，可通过阻断SDF-1与CXCR4的结合，从而抑制SDF-1/CXCR4信号通路激活，目前已进入临床Ⅱ期试验［18-19］。本研究在高脂饲料喂养下进一步给予裸鼠注射AMD3100，结果AMD3100处理12周后裸鼠体重、脂肪重量、肝脏重量和血清瘦素浓度均低于高脂饮食组。高脂饮食后，裸鼠发生肝脏转移的比例明显增加，而经AMD3100处理后发生肝脏转移的裸鼠比例则明显减少，肝脏转移灶数量及肿瘤体积亦明显降低。此外，经AMD3100处理后，移植瘤组织中SDF-1、CXCR4的蛋白和mRNA表达水平均低于高脂饮食组。以上结果表明，高脂饮食可能通过激活SDF-1/CXCR4信号通路而促进结肠癌的肝脏转移。

综上所述，高脂饮食可能通过激活SDF-1/CXCR4信号通路而促进结肠癌的肝脏定向转移，对防治结肠癌肝转移，提高患者预后具有重要意义，但具体机制还有待进一步研究。