lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌组织中的表达及其临床意义

吕炳桦钟路阳黄俏俏李科志胡榜利谢明智

作者单位：530021南宁 1广西医科大学基础医学院；2广西医科大学附属肿瘤医院化疗科

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，结肠癌是结直肠癌的一种重要类型，发病率和死亡率均呈逐年上升趋势［1］。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度＞200 bp的核苷酸，具有广泛的基因表达调控非编码RNA分子。目前研究发现，许多lncRNA异常表达与结直肠癌发生、发展、侵袭及转移密切相关，并可能作为诊断和预后评估的特异性分子标志物［2-3］。SH3PXD2A（SH3 and PX domains 2A）基因是PX结构域蛋白家族成员，与肝癌、卵巢癌等发病密切相关［4］，但lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌中的作用未明确。本研究收集结肠癌手术标本并检测lncRNA SH3PXD2A-AS1的表达水平，分析其与患者临床病理特征及预后的关系，以期为结肠癌的预后判断寻找新的指标。

1 资料和方法

1.1 研究对象

收集广西医科大学附属肿瘤医院2017年1月至2018年10月的40例结肠癌组织及相应癌旁正常组织（距离癌灶边缘3 cm范围内）。其中男性17例，女性23例；肿瘤原发于左半结肠19例，右半结肠21例。纳入标准：⑴经病理诊断为结肠癌；⑵术前未接受局部或系统治疗（如免疫治疗和靶向治疗等）；⑶术后化疗方案为XELOX（奥沙利铂+卡培他滨）。排除合并其他肿瘤、免疫性疾病、严重肝肾功能损伤、感染等患者。本研究经广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。

1.2 RT-PCR法检测结肠癌组织中lncRNA SH3PXD2AAS1的表达水平

RNA提取试剂盒购自凯杰公司，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自BIOMIGA公司，荧光定量PCR仪购自美国AB公司。根据RNA提取试剂盒说明书提取组织中的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA。按照荧光定量PCR试剂盒说明书配制20μL体系PCR反应混合液进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。以GAPDH为内参。PCR引物序列：GAPDH正向引物序列为5'-CCAAGGAGTAAGACCCCTGG-3'，反向引物序列为5'-TGGTTGAGCACAGGGTACTT-3'；SH3PXD2A-AS1正向引物序列为5'-AGGGAGGGGAGAGAGAATGT-3'，反向引物序列为5'-TGCATGGGGAGACAAGGATT-3'。读取目的lncRNA及内参的循环阈值（Ct值），采用2-△△Ct法计算相对表达量。实验重复3次。

1.3 观察指标及随访

收集患者年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期、临床分期、生存时间等临床资料，TNM分期根据第八版美国肿瘤联合会（AJCC）癌症分期手册［5］。

以门诊复诊或随诊、电话或电子邮件等方式进行随访，每隔1～3个月随访1次，随访截至2019年5月10日。随访时间为10～26个月，中位随访时间为18个月。以患者死亡、失访或最后随访时间为终点，统计存活、死亡、失访人数。总生存期定义为自患者入组开始至因任何原因死亡的时间。

1.4 TCGA数据验证

从TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov）下载有关结肠癌的表达谱数据和临床表型数据，采用R语言（版本：3.5.1）提取lncRNA SH3PXD2A-AS1数据，分析其表达水平与临床病理参数及预后的关系。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析。结肠癌组织和癌旁正常组织lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平比较采用配对t检验。lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与结肠癌临床病理特征关系采用独立样本的t检验和χ2检验。采用Kaplan-Meier法计算累积生存率，并采用Log-rank法检验生存曲线的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌组织中的表达

RT-PCR结果显示，lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织（6.53±1.62 vs 4.37±0.96，t=3.445，P=0.002），见图1。

2.2 lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系

根据lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平的中位数（7.53）将患者分为SH3PXD2A-AS1高表达组和SH3PXD2A-AS1低表达组，分析其与临床病理特征的关系，结果显示lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、T分期和N分期无关（P＞0.05），与M分期、临床分期有关（P＜0.05），其中M1期和Ⅲ～Ⅳ期患者中lncRNA SH3PXD2A-AS1的表达水平分别高于M0期和Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05）。见表1。

图1 lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌组织中的表达Fig.1 Expression of lncRNA SH3PXD2A-AS1 in colon cancer tissues

表1 lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系［n（%）］Tab.1 Relationship between the expression of lncRNA SH3PXD2AAS1 and the clinical features of colon cancer patients［n（%）］

2.3 lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与结肠癌患者总生存期的关系

本研究无失访患者，随访期间死亡3例（7.5%）。Kaplan-Meier生存分析显示，SH3PXD2A-AS1高表达组1年、2年累积生存率分别为95.1%、85.3%，SH3PXD2A-AS1低表达组分别为100.0%、87.0%。Log-rank检验结果显示两组患者生存曲线比较差异无统计学意义（χ2=0.326，P=0.586），见图2。

图2 结肠癌患者的生存曲线Fig.2 Survival curves in patients with colon cancer

2.4 基于TCGA数据库验证lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与结肠癌患者临床病理特征及预后的关系

TCGA数据库分析显示，结肠癌组织469例，癌旁正常组织41例，患者平均年龄（67.8±23.7）岁，lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织（t=8.523，P＜0.001），见图3A；lncRNA SH3PXD2A-AS1在M1期患者中的表达水平高于M0期（t=2.351，P=0.032），见图3B；以lncRNA SH3PXD2AAS1表达水平的中位数（7.128）为界值，将患者分为高表达组和低表达组，结果显示两组患者总生存期比较差异无统计学意义（χ2=0.442，P=0.930），见图3C。分析lncRNA SH3PXD2A-AS1表达水平与结肠癌临床病理特征显示，SH3PXD2A-AS1表达与肿瘤的M分期和临床分期有关（P＜0.05），但与其他临床病理特征无关（P＞0.05），见表2。

图3 基于TCGA数据库验证lncRNA SH3PXD2A-AS1D在结肠癌中的表达及与预后的关系Fig.3 Expression of lncRNA SH3PXD2A-AS1 in colon cancer and its relationship with prognosis based on TCGA database

表2 TCGA数据库中验证lncRNA SH3PXD2A-AS1的表达与结肠癌患者临床病理特征的关系［n（%）］Tab.2 The relationship between the expression of lncRNA SH3PXD2A-AS1 and the clinical features of colon cancer patients using TCGA database［n（%）］

3 讨论

lncRNA具有广泛的生物学功能，可参与染色体修饰、基因转录及转录后调控、表观调控及细胞周期调节等过程［6］。研究发现lncRNA异常表达与多种疾病的病理、生理过程密切相关，在肿瘤发生发展中lncRNA也发挥重要作用，既可参与调控肿瘤的发病过程，也可以作为肿瘤诊断和预后判断指标［7-8］。结肠癌的发生发展过程中亦伴随多个lncRNA的异常表达，这些异常表达的lncRNA在肿瘤形成过程中发挥促癌或抑癌作用［9-10］。既往已有研究发现了多个与结肠癌发病密切相关的lncRNA。魏琳琳等［11］发现lncRNA DLX6-AS1在结肠癌组织及细胞中的表达量高于癌旁组织和结肠上皮细胞，且与结肠癌TNM分期相关，高表达患者术后5年生存率较低。ZENG等［12］报道lncRNA PVT1可通过抑制miR-216a-5p表达发挥抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移等作用。也有研究分析lncRNA在结肠癌中的表达情况及其临床意义［13-14］，这些研究表明lncRNA在结肠癌发病中有重要作用，可能作为治疗的潜在靶点。

本研究发现结肠癌组织中的lncRNA SH3PXD2A-AS1的表达水平在癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织，提示lncRNA SH3PXD2A-AS1有可能发挥促癌作用，与范钰等［15］在胃癌的研究中的结果一致。进一步的临床分析显示lncRNA SH3PXD2A-AS1在M1期患者中的表达高于M0期，在Ⅲ～Ⅳ期患者中的表达水平也比Ⅰ～Ⅱ期患者高，提示lncRNA SH3PXD2A-AS1高表达可能与肿瘤进展相关，表达量越高，肿瘤越易发生转移。本研究搜索TCGA数据库中有关结肠癌数据进行验证，亦得到相似的结果。既往也有研究报道lncRNA SH3PXD2A-AS1在其他肿瘤如卵巢癌［16］、胰腺癌［17］和结直肠癌［4］等中的作用。MA等［4］研究发现lncRNA SH3PXD2A-AS1在结直肠癌组织和细胞系中显著上调，且lncRNA SH3PXD2A-AS1过表达与结直肠癌的肿瘤大小和淋巴结转移有关，敲除lncRNA SH3PXD2A-AS1后可抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。BAYARMAGNAI等［18］在乳腺癌中的研究也显示，过表达lncRNA SH3PXD2A-AS1可促进乳腺癌细胞增殖，与本研究结果一致，均提示lncRNA SH3PXD2A-AS1可能是促癌基因。然而在预后方面，本研究临床资料和TCGA数据均显示高表达和低表达lncRNA SH3PXD2A-AS1患者生存时间差异不明显。

本研究结果发现，lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌组织中呈高表达，尤其在发生远处转移和临床分期Ⅲ～Ⅳ期患者中表达更高，因此有望作为判断结肠癌进展程度的指标。但本研究样本量较少，随访时间亦较短，因此尚待进一步明确lncRNA SH3PXD2A-AS1在结肠癌中的作用。