广州市地区7234例新生儿耳聋基因突变分析

李玛叶燕绸 何国炜 董慧敏 李林 胡波 章钧*

我国每年约有2000万新生儿出生，新生儿先天性耳聋的发生率在0.93%～7.7%不等[1]，新生儿中耳聋基因携带率达4.70%[2]。我国耳聋出生缺陷严峻，每年约有4万聋儿出生，导致耳聋的因素很复杂，包括遗传因素、环境因素等。环境因素导致的耳聋随着社会的发展和国民保健水平的提高得到了很大的改善。遗传因素逐渐成为耳聋患儿出生的主要原因，流行病学研究发现中国人群的耳聋主要由GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA等基因突变引起，但不同的地区热点突变存在差异[3-4]。本研究采用微阵列基因芯片技术，对本院新出生的7234名新生儿开展GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12SrRNA的4个基因9个热点的耳聋基因检测，并对266例携带者进行位点验证及基因外显子测序，为基因突变携带者或患者提供监控预防指导以及父母再生育的遗传咨询，对其他位点的挖掘以期建立一套适合本地区的筛查及诊断方案。

1 材料与方法

1.1 标本采集与DNA提取

经患者知情同意后，采集本院产科2015年6月至2019年1月分娩分娩的7234例新生儿脐带血2 mL，EDTA.K2抗凝剂抗凝。使用DNA提取试剂盒按说明书进行DNA提取，测定DNA样本的OD260nm/OD280nm比值应在1.6～2.0之间，OD260nm/OD230nm比值需≥2.0，-20℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

DNA提取试剂盒：Qiamp mini kit，Qiagen（德国，货号：51306）基因检测试剂盒：晶芯®九项遗传性耳聋基因检测芯片试剂盒，博奥生物有限公司（北京，货号：300065）PCRmastermix试剂盒：Takara（日本，货号：9152A）；离心机：Eppendorf，（5424R德国）；PCR扩增仪：ABI9700（美国）；芯片杂交仪：晶芯BioMixer II（博奥生物有限公司，北京）；芯片扫描仪：晶芯®LuxScanTM10K-B（博奥生物有限公司，北京）。

1.3 耳聋芯片检测与结果解读

采用晶芯®九项遗传性耳聋基因检测芯片试剂盒检测与分析常见的9个非综合征型耳聋基因突变热点。简明操作流程为PCR反应、杂交与洗片、芯片扫描判读。芯片杂交结果经扫描后在同位点中探针W出现阳性信号，判读为该位点野生型；M出现阳性信号，判读为该位点纯合突变型；两者均出现阳性信号，判读为该位点杂合突变型。对于线粒体12S rRNA基因突变位点，M出现阳性信号判读为同质突变，两者均出现阳性信号判读为异质突变。

1.4 PCR测序验证

根据基因芯片扫描检出的阳性突变位点分别进行PCR扩增验证。PCR引物采用Primer 3.0在线引物设计软件设计并由上海生物工程公司合成，引物序列、退火温度及扩增片段长度，见表1。PCR反应体系采用PCRmastermix试剂盒按说明书进行扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化测序，测序结果使用chromas软件（Technelysium，Australia）分析。

表1 引物列表Table1 GJB2、SLC26A4、Mitochondria 12 SRNA Primers list

2 结果

2.1 耳聋基因芯片检测结果

7234 名普通新生儿中筛查出基因突变数为266，人群携带率为3.68%（266/7234）。GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA基因携带率见表2。GJB2c.235del C、SLC26A4IVS7-2 A＞G、GJB2c.299 del AT、线 粒 体12S rRNA 1555A＞G、SLC26A4：c.2168 A＞G、GJB3c.538 C＞T、GJB2c.176 del 16 1.9%、GJB2c.35del G和线粒体12S rRNA 1494 C＞T各突变频率，见表3。

表2 7234例样本中4个突变基因的人群携带率[n（%）]Table2 The carrier rate andmutation spectrum of genes in 7234 newborns[n（%）]

表3 9个突变位点突变频率比较[n（%）]Table3 Comparison of mutation frequencies in 9 mutations[n（%）]

2.2 DNA测序验证

基因芯片筛查出基因突变数为266例，且9个突变位点均出现阳性病例，在相应基因外显子测序验证过程中发现，基因芯片筛查出的突变位点与测序结果全部符合。2名新生儿发现同一新的位点突变，即基因芯片检测为GJB2c.235del C杂合突变，测序结果为GJB2c.235delC与c.109G＞A双重杂合突变。病例1中GJB2c.109G＞A杂合突变，遗传来源母亲；GJB2c.235del C杂合突变，遗传来源父亲，见图1。病例2中GJB2c.109G＞A杂合突变，遗传来源父亲；GJB2c.235del C杂合突变，遗传来源母亲。病例3基因芯片检测为SLC26A4IVS 7-2A＞G杂合突变，测序结果为SLC26A4 IVS7-2A＞G与c.1983C＞A双重杂合突变，见图2。该新生儿SLC26A4IVS7-2 A＞G杂合突变，遗传来源母亲；SLC26A4c.1983C＞A杂合突变，遗传来源父亲。

图1 病例1GJB2基因外显子测序结果Figure1 GJB2 coding sequencing result in patient1

3 讨论

耳聋是人类最常见的感觉神经系统障碍，根据2006年第二次全国残疾人抽样调查，推算出我国有听力残疾2004万人，占残疾人总数的24.16%，其中6～14岁的听力障碍儿童达11万[5-6]。耳聋已经严重影响了我国的人口素质，增加了国民经济、医疗负担，粗略估计大约有50%的学语前听力障碍都是由遗传因素引起[7]。GJB2是导致遗传性非综合征型耳聋最常见的基因，21%先天性耳聋患者与该基因有关[8]，其次为SLC26A4基因14.5%，再次为导致药物中毒性耳聋的线粒体12SrRNA基因突变4.0%[9]及GJB3基因突变等。本次研究中发现GJB2基因的突变携带率为2.2%（159/7234），占基因突变数的59.8%（159/266），c.235delC杂合突变占GJB 2基因突变的83%（132/159），突变频率最高。研究数据与其他学者的研究结果GJB2基因阳性率2.6%～3.2%，c.235delC杂合突变占GJB2基因突变54.9%～76.2%接近[10-12]，其次c.299del AT杂合突变13.4%。对携带者进行外显子测序验证中发现2名携带GJB2c.235del C新生儿同时携带GJB2c.109G＞GA杂合突变，该突变位点被临床变异位点数据库（ClinVar）、人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）及耳聋变异位点数据库（Deafness Variation Database，DVD）数据库中收录，依据美国医学遗传学与基因组学学会（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遗传变异分类标准与指南评分[13]，该变异被分类为“可能致病性”。GJB2导致的非综合征型耳聋为常染色体隐性遗传病，可能致病位点的纯合突变或者复合杂合突变可引起非综合征型耳聋。两名新生儿电生理耳聋筛查表现为耳声发射和自动听性脑干反应听力筛查未通过，结合耳聋基因检测结果，两名新生儿为先天性聋儿。因此，将对这2例新生儿进行病例随访，以进一步分析GJB2c.109 G＞A在广州市的致聋性，为广州市下一步开展耳聋基因筛查是否增加GJB2c.109G＞A做出指导。

SLC26A4基因突变与Pendred综合征（前庭导水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿）和单纯前庭导水管扩大和（或）内耳畸形有密切关系[14-15]。东亚人群中最常见的是外显子8上游的IVS 7-2 A＞G和外显子19的c.2168A＞G突变类型[16]。本次研究中发现SLC26A4基因的突变携带率为1.18%（85/7234），与王秋菊等[17]在460例新生儿中筛查的SLC26A4致病基因携带率1.13%基本一致，占基因突变数的32.0%（85/266）。对携带者进行外显子测序验证中发现1名患儿携带SLC26A4：IVS7-2 A＞G同时携带c.19 8 3C＞A杂合突变。SLC26A4c.1983C＞A在ClinVar、HGMD、DVD数据库中收录，ACMG遗传变异分类标准与指南评分，该变异被分类为“可能致病性”，导致的非综合征型耳聋为常染色体隐性遗传病，可能致病位点的纯合突变或者复合杂合突变可引起大前厅导水管综合征。临床上早期发现该基因突变患者，结合影像资料，可以通过医生的指导、严格的活动限制和密切的观察来保存患者的残存听力，避免引起颅内压变化的因素，例如感冒发热、不健康的生活方式及头部撞击或外伤等[18]。因此，SLC26A4基因的检测，对于预防该基因引起的耳聋和耳聋的恶化有很重要的意义。

GJB3基因突变可导致常染色体隐性遗传性耳聋和常染色体显性遗传性耳聋[19]。GJB3c.538C＞T杂合突变携带者临床可表现为迟发型高频听力下降[20]。本次研究中GJB3基因突变的携带率为0.1%（8/7234），占基因突变数的3.0%（8/266），建议携带者定期监测听力功能，尽早发现和干预听力功能下降的问题。

大量研究证实，线粒体的突变与耳聋密切相关，确定的与药物性耳聋关系密切的突变是线粒体12SrRNA1555A＞G和1494C＞T[21-23]，突变的个体对氨基糖甙类抗生素耳毒性具有高度的敏感性。由于线粒体的基因突变引起的感音神经性耳聋可以出现在婴幼儿，少年或成年期，且应用单次剂量即可导致携带此突变个体的重度听力损失，不可逆转，必须尽量避免使用氨基糖苷类抗生素。

广州市天河区单一医院新生儿耳聋基因人群携带率为3.68%，与中国人群的携带率基本一致[24]，新生儿耳聋基因筛查可以有效的筛查出人群中的基因携带者。耳聋基因筛查能够从分子水平发现可能存在听力障碍的新生儿，基因携带的情况下继续进行基因检测，能有效发现患儿，为耳聋儿童的早期发现与早期干预提供参考与指导，也可为患儿父母的再生育提供优生优育指导。