耳聋基因突变检测国家参考品的研制

于婷 孙楠 曲守方 黄杰

分子流行病学调查显示，在我国最常见的四个耳聋基因是GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和线粒体12S rRNA基因。GJB2基因是中国人群中常见的非综合征性耳聋致病基因，其中235delC是GJB 2基因常见的突变形式。GJB 3基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传性非综合征型耳聋。SLC26A4基因上IVS7-2A＞G突变是中国人大前庭水管综合征中的热点突变。线粒体上的1555A＞G突变与氨基糖甙类抗生素所致的听力下降密切相关。临床上采用听力筛查与基因检测相结合的方法[1]，有助于早期发现耳聋型高危患者，通过及时干预与治疗以降低高危人群的发病率。

目前在临床上，耳聋基因突变检测的应用已经越来越普遍，并且随着二胎计划及国人对优生优育认识程度的增加，该检测项目将会在更大范围推广应用。由于现有耳聋基因检测试剂盒的检测方法多种，包括微阵列芯片法、飞行时间质谱法、联合探针锚定聚合测序法、荧光PCR法等，如何评价这类试剂盒的性能指标，保障临床样本检测结果的准确性、有效性。采用耳聋基因突变参考品进行验证是一个比较直接的办法。中国食品药品检定研究院2016年起开始研制耳聋基因突变检测性能评估的国家参考品，涵盖上述4个耳聋基因20个碱基位点，为相关试剂盒的注册检测及临床检验室间质评等提供可靠的参考品。

1 材料与方法

1.1 样本

血样来自济宁妇幼保健院、天津华大临检中心、绍兴市妇幼保院、北京301医院和台州医院。

1.2 验证试剂

十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒（微阵列芯片法）购自北京博奥生物有限公司；二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒（飞行时间质谱法）购自广州市达瑞生物技术股份有限公司；耳聋基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）购自华大生物科技（武汉）有限公司；耳聋易感基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）购自潮州凯普生物化学有限公司；先天性耳聋基因检测试剂盒（荧光PCR法）、药物性耳聋基因检测试剂盒（荧光PCR法）和PDS基因检测试剂盒（荧光PCR法）均购自济南英盛生物技术有限公司；4项耳聋基因检测试剂盒（ARMS-PCR法）购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 主要检测仪器

晶芯®LuxScan™10K-B微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物有限公司生产并提供）、DR MassARRAY飞行时间质谱检测系统（广州市达瑞生物技术股份有限公司生产并提供）、BGISEQ-500基因测序仪（华大生物科技（武汉）有限公司生产并提供）、HB 2012A导流杂交仪（潮州凯普生物化学有限公司生产并提供）、ABI 7300荧光PCR仪（美国ABI生产，济南英盛生物技术有限公司提供）、Bio-Rad S1000PCR仪（美国Bio-Rad公司生产，中生北控生物科技股份有限公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 样本筛选及采集

根据目标检测的4个基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12SrRNA）的20个位点（GJB2基因的c.235delC、299_300del AT、c.35delG、c.176_191del 16突变，GJB3基因的c.538 C＞T、c.547G＞A突变，SLC26A4基因上的IVS7-2A＞G、c.2168 A＞G、c.1174 A＞T、c.1229 C＞T、c.1226G＞A、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162 C＞T、c.281C＞T、c.589 G＞A、IVS15+5G＞A突变，及线粒体12S rRNA基因的1095T＞C、1494C＞T和1555A＞G突变）的序列设计了10对PCR扩增引物，对每个样本进行PCR反应，将获得的基因扩增片段进行Sanger测序。确认为野生型或突变类型后，按照临床外周血采集方法，采用EDTA抗凝真空采血管采集满足要求的外周血（30mL/人），于-80℃保存。本研究的临床基本信息收集和临床血样的采集均获得了患者或其家属的同意，并签署了知情同意书。

1.4.2 国家参考品制备

将含野生型或突变型耳聋基因的外周血样本置于室温融化后混匀，取50μL血液样本滴加到903滤纸上，血液均匀扩散为圆形，形成血斑，自然晾干呈深褐色后，封装入含有干燥剂的密封袋内，并贴上标签。混匀全血时应尽量轻柔，以减少溶血。每次仅制备一个样本的干血片，以防样本间混淆。样本编号一一核对，干血片组装为两人复核，保证组装正确。因部分耳聋基因突变样本未收集到，暂时采用DNA样本，用Tris缓冲液稀释后进行分装，25μL/支。

1.4.3 参考品验证

采用6个厂家8个试剂盒对参考品进行耳聋基因突变位点的验证，这些试剂包含6种检测原理，各家检测范围不完全一致。根据各企业说明书要求，对每份样本提取的DNA及稀释至1ng/μL的DNA进行检测，若1ng/μL浓度的DNA样本未能检出相关的突变位点，则按照企业说明书声称的检测限浓度进行复测。对于检测结果，要求应检出试剂盒检测范围内的突变位点；检测范围外的突变位点结果应为野生型。

1.4.4 国家参考品稳定性和均匀性验证

随机取4套参考品，分别于37℃放置1、2、3、4周后，采用联合探针锚定聚合测序法进行检测，上述稳定性数据同时作为均匀性数据。

2 结果

2.1 参考品组成

共筛选出18个位点突变阳性的临床样本及3例阴性样本（上述20个位点均为野生型）。因SLC26A4基因的1229位点（19号样本）和线粒体1494位点（20号样本）突变的阳性样本未收集到，只能采用DNA样本，用Tris缓冲液稀释后进行分装，25μL/支，最终形成23份/套的耳聋基因突变检测国家参考品，具体样本信息表详见表1。

表1 耳聋基因突变检测国家参考品样本信息表Table1 The information list of the national reference material of detection of deafness gene mutations

2.2 国家参考品验证结

对于试剂盒检测范围内的突变位点，大部分试剂盒均能检出样本的突变位点，但以下样本，出现双突变位点或三突变位点情况：P4，除已知突变位点外，多数试剂还检出299_300del AT；P10、P11、P17，除已知突变位点外，多数试剂还检出IVS7-2杂合突变；P19情况最复杂，各家结果不一，厂家1和厂家5-2除已知突变位点外，还检出IVS7-2杂合突变，厂家2仅检出已知突变，经其测序验证无SLC26A4：IVS7-2A＞G。厂家3采用2种方法通过2次试验，均检出c.1229C＞T杂合突变，但IVS7-2A＞G位点在不同检测浓度检测结果不一致：采用测序法，P19样本DNA原浓度未检出，稀释至1ng/μL后可检出，详见表2；当采用飞行时间质谱法，均出现IVS7-2突变碱基峰，但低于野生型峰。厂家4采用的是PCR+导流杂交法，检出了3个位点突变情况，包括1229M杂合突变、IVS-M杂合突变以及299M杂合突变。厂家5-1、5-3以及厂家6，1229C＞T和IVS7-2A＞G均不在其检测范围内，均表现为野生型；对于P9、P14、P16，厂家4检出了1555突变，但经测序验证均无1555突变。

表2 厂家3采用测序法测定的P19样本SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变位点结果Table2 Results of IVS7-2A＞Gmutation site of SLC26A4 gene in P19 sample determined bymanufacturer 3 with sequencingmethod

对于不同检测浓度样本，大部分厂家的试剂均可检出，仅厂家6在检测1ng/μL浓度的参考品样本时，部分未检出，按照试剂盒的检出限稀释样本至5ng/μL时，可检出。

最终：本批次国家参考品协作验证的全部结果汇总见下表3。

表3 耳聋基因突变检测国家参考品验证结果汇总表Table3 The summary of validation results for the national reference material of detection of deafness gene mutations

2.3 参考品稳定性结果

对37℃放置1、2、3、4周后的参考品进行检测，结果显示，该4套参考品的突变位点的检测结果与该公司检测正常保存样本结果一致。后在使用过程中，将定期对该国家参考品进行期间核查及长期稳定性研究。

2.4 国家参考品各位点汇总及质量标准的确定

通过6个厂家8个试剂盒的验证，最终确认耳聋基因突变检测国家参考品中：N1～N3未检测到以上20个突变位点。P4增加c.176_191del16位点缺失突变，P10、P11和P17增加IVS7-2A＞G位点突变，P20增加c.235delC缺失突变。各家对P19样本中的IVS7-2A＞G位点检测结果存在一定争议，分析可能存在杂合突变或者样本被污染。最终P19定为：若c.1229C＞T为试剂盒检测范围内的位点，可仅检出该突变。不对IVS7-2 A＞G缺失突变作要求。此外，因P19和P20样本未采集到血样，采用的是DNA参考品，各家测定浓度差异较大。因此在实际检测之前，需对两样本的DNA浓度进行测定，若浓度低于试剂盒声称的检测限，允许检测范围内的位点检测结果为野生型。

通过以上结果确认采用此套参考品的质量标准为：试剂盒检测范围内的位点应检出；检测范围外的位点应为野生型。DNA参考品（P19和P20）浓度若低于试剂盒声称的检测限，允许检测范围内的位点检测结果为野生型。P19参考品，若1229 C＞T为试剂盒检测范围内的位点，可仅检出该突变。

3 讨论

耳聋是人类最常见的感觉缺陷型疾病之一。耳聋的致病因素主要有环境因素、遗传因素，或二者共同存在，据报道有超过65%的耳聋是由遗传缺陷引起的[2-5]。我国每年新增约30000例先天性耳聋患儿[6]。大部分为重度、极重度感音神经性耳聋，这严重影响了患者的交流和认知能力，也对个人、家庭及社会造成了巨大的经济和生活负担，所以耳聋早期诊断、早期干预和早期治疗的工作非常重要。

目前已有注册证的各类耳聋基因突变检测试剂盒有多种[7-12]，因其方法原理不尽相同，试剂盒的准确性、特异性、检测限等性能必然有所差异，这些差异会不会对临床结果有影响？有效评价方法之一，就是建立耳聋基因突变检测参考品。根据《医疗器械监督管理条例》《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）精神，将“组织体外诊断试剂国家标准品、参考品的制备和标定工作”的责任主体明确为中检院，以及参考上述研究背景，我院开展了耳聋基因突变检测国家参考品的研制工作。通过分子流行病学调研，采集了我国最常见的耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和线粒体12S rRNA基因相关突变位点阳性的外周血，制备成国家标准品。6个厂家8个试剂盒的协作验证，大部分参考品的各突变位点均能被检出，而且部分参考品还检出了新的突变位点。一方面表明国家标准品适用性良好，另一方面，新突变位点的检出应是受限于所选用的方法和现有的认识，在研制的时候，不一定能完全给出其全部突变位点信息，通过协作验证，使得参考品的突变位点信息更为完善。验证过程中，也发现存在一些问题，某检测试剂在多个参考品中检出了12SrRNA的1555A＞G位点的突变，而测序结果表明无该位点突变。这就需要该检测试剂厂家主动找原因进行分析，是试验过程中污染还是试剂设计问题？对于3个阴性样本（N1～N3），限于目前技术原因和认识水平，目前只确认此20个突变基因位点为野生型，但不排除有其他突变基因位点存在，这个将随着参考品在实际应用过程中及时进行更新。

从DNA测序技术应用在遗传性耳聋的分子病因检测以来，已经发现超过220个耳聋基因[13]，而且最新的遗传信息学表明，与遗传性聋相关的基因达300～500个[14]。但多数相关基因突变所致的发病率并不高，因此要制备数量如此多的以全血为基质的耳聋基因国家参考品盘，必然是一个耗时和昂贵的工程。但就目前来说，这套国家参考品突变位点虽仅为20个常见突变位点，但也基本涵盖了市场上所有具有注册证的耳聋基因突变检测试剂盒所检测的突变位点类型，可以满足评价现阶段各试剂盒基本性能的要求，并且将在今后根据需要逐步扩充新的耳聋基因突变位点。这套参考品必将为我国耳聋的早期防治工作发挥重要的作用。