贝赫切特综合征患者肠道菌群微生物宏基因组学分析

刘秀梅 张成伟 刘淼

贝赫切特综合征（Behcet syndrome，BD），即白塞病，是一种可侵害人体皮肤、口腔、血管、肺等多个器官的全身免疫系统疾病，临床以口腔溃疡反复发生、葡萄膜炎、皮肤损害为特征，青壮年为多发群体，若不及时治疗，可能会引起患者肠穿孔、失明，甚至死亡[1-2]。既往研究认为，BD发生与自身炎症反应和遗传因素有关[3]，而近期研究发现，肠道微生物异常可通过调节T免疫细胞亚群参与BD等许多免疫系统疾病的发生[4]。宏基因组学是通过环境样品构建宏基因组文库，研究环境样品中所有微生物构成及功能的新方法[5]。本研究采用宏基因高通量测序技术分析BD患者肠道微生物群改变，初步探讨肠道微生物群改变在BD发生中的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2018年1月本院收治的BD患者18例。纳入标准：①符合BD诊断标准[6]；②均为活动期患者；③入组前1个月未服用相关药物治疗；④患者均知情同意。排除标准：①合并心血管疾病、糖尿病等其他全身疾病；②合并肿瘤者；③合并药物相关性结肠炎、非特异性结肠炎、合并克罗恩病等肠道疾病。BD组中男性14例，女性4例，年龄21～55岁，平均（38.27±8.58）岁，身体质量指数（Body Mass Index，BMI）：（18.57～26.93）kg/m2，平均（23.02±2.89）kg/m2。另选取本院性别、年龄、BMI相匹配的健康人群24例作为对照，其中男性19例，女性5例，年龄18～52岁，平均（36.61±8.02）岁，BMI：（18.34～27.11）kg/m2，平均（23.25±3.10）kg/m2。本研究获得本院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及宏基因组DNA提取

留取所有受试者新鲜粪便，立即送到实验室，在2 h内进行宏基因组DNA提取。严格按照QIAamp FastDNA StoolMiniKit（北京博迈斯科技发展有限公司）说明书步骤完成粪便DNA提取，然后通过凝胶电泳检测DNA完整性，Nano Drop微量紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国）检测DNA纯度，采用Qubit荧光计（Life Technologies，美国）检测DNA浓度。

1.2.2 文库构建及测序

取2.5μg样品DNA于500μL打断管中，加入0.1×TE溶液65μL，于超声破碎仪（sonics，美国）中打断，然后进行末端修复、连接接头，将连接接头产物浓缩30min，凝胶电泳后回收620bp大小的条带，进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性30s，1个循环，95℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，15个循环，72℃延伸5min，1个循环，4℃保存10min。PCR产物凝胶电泳后进行回收。向反应管中加入4种dNTP（荧光标记）、DNA聚合酶、扩增产物，每次循环掺入一种碱基，扩增过程中收集荧光信号；恢复3′端粘性后，再掺入第二种碱基，依次类推，获得DNA片段序列。

1.2.3 测序数据处理与基因比对

高通量测序所得数据去除接头引物、去除Human序列、去除低质量短读码框（reads），最终得到高质量reads。具体方法：将含有Adaptor接头序列污染、含有N碱基数目≥3的reads去除，截切序列3′端，将质量值＜20的碱基，过滤截切后长度不足60%原长的reads去除；若样品来源于宿主，尽可能找到与宿主亲缘关系较近物种的基因组或宿主基因组，将含有宿主序列污染的reads去除。随后将正常人与BD患者测序结果与人类肠道宏基因组进行比对。采用一致性＞90%的质量控制，即错比碱基数量不超过总碱基数的10%。

1.2.4 物种注释

通过SOAPal igner2.21软件将高质量reads与NCBI数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）已知的微生物（细菌、病毒、真菌、古细菌）序列进行比对，在界门、纲、目、科、属、种等各水平进行分类，并统计丰度。

1.2.5 物种LEf Se差异分析

组间群落差异分析（LDA EffectSize，LEf Se）对丰度差异的检测是采用非参数秩和检验，能发现丰度差异明显的菌群，用LDA表示物种丰度对差异的影响。

2 结果

2.1 基因集构建

BD组插入片段平均长度为1892 bp，平均测得reads数为19837218，平均高质量reads数占比95.16%。对照组插入片段平均长度为1956 bp，平均测得reads数为54673420，平均高质量reads数占比95.73%。

2.2 BD患者与正常人细菌门类分布差异

BD患者与正常人的优势菌群主要是硬壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。BD患者中Bacteroidetes占4.21%，远低于正常人，BD患者中Proteobacteria占42.80%，远高于正常人，详见表1。

表1 BD患者与正常人细菌门类分布比较[n（%）]Table1 Comparison of distribution of bacterial phylum categoriesbetween BD patientsand normal people[n（%）]

2.3 BD患者与正常人肠道微生物属种差异

BD患者与正常人胃肠道微生物在属水平上有194个菌属存在差异，在种水平上有887个菌种存在差异。覆盖基因最多的前20种优势菌在种水平上分布差异见图1，其中BD患者优势菌包括Collinsella Spp.、Bilophila spp.及Bacteroides spp.等，正常人优势菌包括Clostridium spp.、Roseburia spp.、Methanogens等。

图1 BD患者与正常人胃肠道微生物在种水平上分布差异Figure1 Distribution of gastrointestinalmicrobes atspecies levelbetween BD patients and normal people

2.4 LEfSe分析肠道微生物种属差异

LEfSe分析结果显示，BD患者显著富集菌包括Mitsuokella、Bacteroides、Clostridium、Bacteroides、Candidatus、Rikenella、Collinsella、Bilophila，正常人显著富集菌包括Methanomethylophilus、Acidiphilium、Clostridium、Methanoculleus、Bacteroides、Roseburia、acteroides等，见图2。

图2 BD患者与正常人胃肠道微生物LE f Se分析结果Figure2 LEfSe analysis results of gastrointestinalmicrobes between BD patients and normal people

3 讨论

BD是一种受遗传和环境因素影响的系统性血管疾病。肠道菌群作为一种宿主因子，近年来因其在BD发病机制中的潜在作用而受到广泛关注[7]，但与BD发生发展的关系尚未阐明。本研究采用宏基因组学方法分析BD相关肠道菌群微生物特征，结果发现，相较于正常人，在门水平上，BD患者肠道Proteobacteria增多，而Bacteroidetes减少；在属种水平上，大部分BD患者优势菌属于Proteobacteria，BD患者肠道富集菌还包括Collinsella Spp.、Bilophila spp.及Bacteroides spp.，大部分正常人优势菌属于Bacteroidetes，如Clostridium spp.、Roseburia spp.、Methanogens.以上结果提示BD患者肠道微生物缺乏产甲烷菌、产丁酸菌，富集产乳酸菌、硫酸盐还原菌，与Shimizu[9]以日本BD患者为研究对象，采用16 s RNA测序结果一致。但Consolandi[8]等人以意大利BD患者为研究对象，结果显示，相对于正常人，BD患者Roseburia和Subdol igranulum菌属相对丰度下降，丁酸盐含量减少，与本研究结果稍有偏差，说明种族和地区可能会对BD患者肠道微生物改变造成影响。产乳酸菌Collinsella Spp.属于革兰阳性菌，谢佳[10]等人认为乳酸菌可作为益生菌调节肠道菌群平衡，有助于肠黏膜的修复，广泛用于消化不良、便秘等消化道系统疾病治疗。Liu[11]等人从类风湿关节炎患者和健康人粪便中提取细菌DNA，分析两组肠道菌群的丰度、乳酸菌群落结构发现，风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者粪便菌群中乳酸菌（10.62±1.72）拷贝/g明显多于健康组（8.93±1.60）拷贝/g，RA患者在丰度、均匀度方面均有显著增加，认为乳酸菌群落与类风湿关节炎的发生发展之间存在潜在关系。类风湿关节炎发生机制可能与乳酸菌肽聚糖生物学活性有关，肽聚糖作为乳酸菌细胞壁成分之一，可诱导机体产生特异性或非特异性免疫反应，并诱导产生抗炎或促炎细胞因子[12-13]。肽聚糖是Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）的配体，Liang[14]等人研究发现，与健康对照组相比，活动期BD患者肽聚糖水平明显增加，认为TLR2信号通路可能与BD发病有关。结合本文研究结果，推测乳酸菌可能通过细胞壁的肽聚糖，激活TLR2信号通路而引发BD。

硫酸盐还原菌Bilophila spp.在人体肠道内广泛存在，是以无机或有机化合物作为电子供体产生硫化氢的的的厌氧微生物。已有研究发现，其与结肠疾病的发生相关[15]。硫酸盐还原菌作为革兰阴性菌，可通过产生脂多糖诱发炎症，另外，还能抑制丁酸盐氧化，使丁酸盐含量减少，而产丁酸菌Clostridium spp.和Roseburia spp.对肠上皮屏障具有保护作用，对机体免疫状态具有维稳作用，所以丁酸盐的减少会引起肠上皮屏障受损，有助于致病分子入侵[16]。本研究认为，BD的发生可能与硫酸盐还原菌破坏肠上皮屏障、抑制丁酸盐氧化有关。

综上所述，Collinsella Spp.、Clostridium spp.和Roseburia spp.有利于机体免疫稳态的维持，但肠道微生物过度生长的Bilophila spp.可能会打破这种平衡，使Collinsel laSpp.过度生长，而Clostridium spp.和Roseburia spp.生长抑制，从而损伤肠上皮细胞，促进脂多糖、肽聚糖等致病分子入侵肠上皮细胞，并通过TLR2信号通路引起T细胞亚群失调，引发BD。