自贡地区HBV基因BCP区1762/1764及前C区1896位点突变与HBV相关性肝癌的相关性研究

邱顺华 张德文 刘勇

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的感染仍是全球性的问题，乙肝病毒感染的三部曲：慢性乙肝（Chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化（liver cirrhosis，LC）、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是严重影响乙肝患者健康和经济的重大疾病。全球约有2.4亿慢性乙肝患者，这也是HCC发生的主要致病因素[1-2]。HCC是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第六位，死亡率居癌症患者死亡原因的第三位[3]。HCC居自贡地区恶性肿瘤发病率和死亡率的第二位，严重危害当地居民的生命和健康[4]。

HBV复制要经过逆转录，而逆转录酶缺乏有效的碱基校正修复功能，容易发生自然变异，发生变异后容易对药物耐药及危害加大[5]。HBV核心启动子（basal core promoter，BCP）区1762/1764突变的HBV较野生型HBV具有更强的复制能力及对药物的低敏感性，与活动性肝炎、肝硬化、HCC、急性肝功能衰竭等相关[6-7]。HBV前C区（precore，PC）1896是HBV的常见变异，是影响药物持续疗效的一个重要因素[8]。同时有研究表明HBV BCP区1762/1764突变、前C区1896位点突变与乙肝患者病情正相关[9]，但也有报道这些HBV基因突变与HCC的关系存在争议。HBV基因型的分布存在着地理性差异，与HCC的关系尚未完全明确[10]。

本文对自贡地区CHB、LC和HCC患者的HBV基因型、BCP区1762/1764及前C区1896位点基因突变进行检测，探索HBV基因型及基因突变与本地区HCC的关系，对指导自贡地区HBV相关性HCC的临床早期诊断与提前干预提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 一般资料

标本收集本院2015年9月至2018年6月门诊和住院患者，经本院确诊的乙肝性相关疾病患者：慢性乙肝患者（CHB组）50例，肝硬化（LC组）45例，肝癌（HCC组）46例，且患者血清HBV-DNA水平≥103IU/mL，男性患者99例，女性患者42例，平均年龄（52.57±12.44）岁，其中HCC组、LC组、CHB组患者的平均年龄分别为（56.54±12.15）岁、（55.80±9.17）岁、（46.00±12.76）岁。乙肝相关疾病患者的诊断根据《慢性乙型肝炎诊断标准（2015年版）》[11]。排除标准：①重叠或合并感染其他肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒；②转移性肝癌；③其他非HBV感染导致的肝癌；④伴有其他恶性肿瘤病史。

1.2 仪器与试剂

主要仪器：SLAN-96P实时荧光定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司），生物安全柜（博科控股集团有限公司），冷冻高速离心机TGL-16R（珠海黑马医学仪器有限公司）。试剂：乙型肝炎病毒前C区1896位点基因突变检测试剂盒和乙型肝炎病毒BCP区1762/1764位点基因突变检测试剂盒由武汉百泰基因工程有限公司提供，乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 研究标本的收集

收集CHB、乙肝相关性LC、乙肝相关性HCC患者的血清作为研究标本，首先用红头管采集3mL左右血液，然后4000r/min离心5min分离血清，收集500μL左右血清标本分装于1.5mL离心管内，置于-20℃保存备用。

1.3.2 HBV基因分型检测

HBV基因分型检测采用多通道荧光PCR法。检测原理：采用核酸释放剂快速裂解和释放血清样本中的乙型肝炎病毒DNA，针对乙型肝炎病毒B、C和D型序列设计3套特异牲引物及荧光探针，配成PCR反应液，然后在实时荧光定量PCR仪上，采用多通道荧光PCR法对B、C和D基因型进行分型检测。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 HBV前C区1896位点及BCP区1762/1764位点基因突变检测

HBV基因位点突变检测采用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）荧光PCR法（ARMS-PCR）[12]。检测原理：设计两条特异性引物A和B，对野生型和突变型序列的扩增效率不同，造成样本在两种PCR反应液下得到的Ct值也不同。实验操作严格按照试剂盒说明书进行：首先采用热裂解法提取HBV DNA，然后在PCR反应液A和反应液B中进行荧光PCR扩增，扩增结束后，分别记录PCR反应液A和反应液B扩增所得Ct值，记为Ct（A）和Ct（B）。若|Ct（A）-Ct（B）|≤7.00，则该对应的基因位点存在突变；若|Ct（A）-Ct（B）|＞7.00，则该对应的基因位点未突变或突变型含量低于检测下限。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行分析。计数资料用n（%）表示；计量资料用（±s），用卡方检验。两组间采用t检验；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性乙肝组、肝硬化组与乙肝相关性肝癌组一般资料比较结果

e抗原阳性率方面比较，HCC组低于CHB组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HCC组也低于LC组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。HBV DNA含量水平比较，HCC组均低于CHB组和LC组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；HBV DNA＞105%比较，HCC组也均低于CHB组和LC组（P＜0.05），见表1。

表1 慢性乙肝组、肝硬化组与乙肝相关性肝癌组一般资料比较情况[n（%）]Table1 The general clinical data of CHB group，LC group and HBV-HCC group[n（%）]

2.2 乙肝相关疾病患者HBVBCP区1762/1764位点突变情况

乙肝相关患者中，男性与女性患者间的HBV BCP区1762/1764位点突变率差异无统计学意义（P＞0.05）。HBV BCP区1762/1764位点突变率在HCC组与CHB组间的差异具有统计学意义（P＜0.05），而LC组与HCC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 乙肝相关疾病患者HBVBCP区1762/1764位点突变情况[n（%）]Table2 Mutations of HBV BCP 1762/1764 in hepatitis B-related patients[n（%）]

2.3 乙肝相关疾病患者HBV前C区1896位点情况

乙肝相关患者中，HBV前C区1896位点突变率在男性与女性患者间的差异无统计学意义（P＞0.05）；而在HCC组与CHB组间和HCC组与LC组间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 乙肝相关疾病患者HBV前C区1896位点突变情况[n（%）]Table3 Mutations of HBV PC1896 in hepatitis B-related patients[n（%）]

2.4 乙肝相关疾病患者HBVBCP区1762/1764位点及前C区1896位点突变情况

HCC患者组HBV前C区1896和BCP区1762/1764位点同时突变率为78.3%，明显高于CHB组患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）；同时也高于LC组患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而BCP区1762/1764单一突变型，主要存在于LC患者中；前C区1896单一突变型和野生型，主要存在于CHB患者中，见表4。

表4 慢性乙肝、肝硬化及肝癌患者HBVBCP区1762/1764位点及前C区1896位点突变分析[n（%）]Table4 Analysis of HBV BCP 1762/1764 and PC1896mutation in HCC，LC and CHB patients[n（%）]

2.5 乙肝相关患者不同HBV基因型的BCP区及前C区突变情况

CHB组、LC组和HCC组乙肝患者中，不同HBV基因型的BCP区1762/1764和前C区1896突变率差异均无统计学意义（P＞0.05）。同时可以看出，无论是B型还是C型的乙肝相关患者，疾病进程较重（HCC组，LC组）的受试者携带BCP区1762/1764突变型或前C区1896突变型的比例均高于慢性乙肝患者（CHB组）。各组乙肝患者B基因型与C基因型的BCP1762/1764及PC1896位点突变率比较，P＞0.05差异无统计学意义见见表5。

表5 乙肝相关患者不同HBV基因型的BCP区及前C区突变情况[n（%）]Table5 Association of BCPand PCmutations with HBV genotype[n（%）]

3 讨论

乙肝相关性HCC的发病机制涉及因素较多，HBV感染慢性化是导致HCC发生的重要原因之一，HBV在慢性持续感染过程中，在机体自身免疫及药物的作用下，基因易发生突变，从而使病毒具有更强的致病性，最终导致乙肝慢性化、严重化，甚至可能导致癌变[13-14]。本文研究显示HCC组患者更容易出现血清学HBeAg为阴性，同时HCC组患者HBVDNA含量水平低于CHB组和LC组，可能原因有：①CHB发展到HCC一般需要一个漫长过程，肝细胞内HBV DNA分布从弥散向局灶演变，而外周血释放HBV的特点为低复制、高积累、低排除；②HBV基因整合到肝细胞基因组，从而降低HBV复制能力[15]。

HBV基因突变在肝癌发展过程中起到重要角色，与HCC发展密切相关的HBV基因突变区域有核心启动子区域（BCP）、前S基因系列、前C区等[16-17]。Fang等[18]前瞻性研究发现HBV BCP区1762/1764突变者患HCC的发病率要远高于未突变者。Xu等[19]研究表明HBV携带者，疾病进程较重的受试者携带HBVBCP区1762/1764突变型的比例明显增高。本文研究显示，自贡地区HCC患者HBVBCP区1762/1764突变率高于CHB组患者，而与LC组比较差异无统计学意义，该结果表明HBVBCP区1762/1764突变与肝癌和肝硬化的发生密切相关；但HBVBCP区1762/1764突变不能作为区分肝硬化进展为肝癌的标记物，与闪明海等[20]研究结论存在一定差别；同时本研究结果表明HBV基因BCP区突变是慢性乙肝进展为肝硬化的致病因素，但可能不是肝癌的主要致病因素[21]。HBV前C区1896位点突变是HBV的常见突变位点，MalikA等[22]研究发现HBV前C区1896突变率在CHB、LC及HCC患者中逐渐升高。本文研究提示自贡地区HCC患者HBV前C区1896突变率高于CHB组和LC组患者，结果表明HBV前C区1896突变可能与HCC发生密切相关。

本文研究还发现，HCC组HBV前C区1896和BCP区1762/1764位点同时突变率最高，结果表明HBV两个基因位点同时突变可能导致慢性HBV感染患者病情更易严重化，与HC C的发生可能存在一定关系。HBV基因型的分布存在地域和人种的差异[10]。本文研究结果显示无论是B型还是C型的乙肝相关患者，疾病进程较重（HCC组、LC组）的患者携带BCP区1762/1764突变型或前C区1896突变型的比例明显高于CHB组患者，但是乙肝患者各个阶段HBV基因B型和C型的两个区域突变比例差异均无统计学意义，与徐君等[23]研究江苏地区情况不一致，可能原因：①不同地区HBV基因亚型不一样，②生活习惯或环境可能会影响HBV突变，③可能存在其他基因区域合并突变，④本文研究对象CHB样本量相对较少，有待于进一步提高样本量深入研究。

综上所述，本文从HBV基因型及基因变异角度阐述了CHB、LC与HCC之间的关系。本文研究结果对了解自贡地区HBV相关性肝癌的发病病因提供了有意义的资料，对指导本地区HBV相关性HCC的临床治疗、早期诊断与提前干预提供了一定的科学依据。