基于Taqman荧光ARMS-PCR技术检测CYP3A5基因多态性方法的建立

朱小亚 黄志文 蒋析文

人类CYP3A5基因位于第7号染色体，全长31.8 kb，包含13个外显子，编码的蛋白由502个氨基酸组成。CYP3A5野生型为CYP3A5*1，研究表明，携带CYP3A5*1等位基因的个体，CYP3A5蛋白表达水平及蛋白活性显著高于纯合突变型个体[1]。CYP3A5基因存在多个等位基因的突变，如CYP3A5*2、CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6等，其中，CYP3A5*3（A＞G，SNP登记号：rs776746）在各种族中发生突变频率最高[2-6]。该等位基因位于第3内含子69 86位核苷酸，当6 986位核苷酸突变为G（CYP3A5*3）时可形成一个隐含的受体剪接位点，直接导致终止密码子提前，使CYP3A5蛋白质无法表达，最终使CYP3A5*3酶活性明显降低甚至消失[7-8]。研究表明CYP3A5在他克莫司的代谢中有着重要作用，其活性降低可导致他克莫司的血药浓度升高[9]。他克莫司（tacrolimus，FK506）为大环内酯类免疫抑制剂，临床上广泛用于肝、肾、心、肺、胰等器官移植患者的免疫抑制治疗。器官移植患者应用他克莫司后血药浓度偏低可导致急性排斥反应和药物敏感性降低；血药浓度偏高则容易发生肾毒性、神经毒性、糖尿病、高血脂症、高血压和胃肠道紊乱等不良反应，导致他克莫司毒副作用的发生。CPIC指南建议携带CYP3A5*3/*3基因型的移植患者减少他克莫司的用药剂量，以避免发生药物不良反应。本研究基于Taqman荧光ARMS-PCR技术，建立一种CYP3A5*3基因多态性的检测方法对于临床指导器官移植患者服用他克莫司剂量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

HotStart Taq Master Mix、2×Taq PCR Master Mix（购自天根生化科技（北京）有限公司；DL1000DNA Marker、CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型人工合成质粒（购自生工生物工程（上海）股份有限公司）；核酸提取或纯化试剂（磁珠法）（货号：DA0643）（由本公司提供）；ABI7500Real-time PCR仪、Nanodrop2000超微量分光光度计（均购自美国Thermo Scientific公司）；水平电泳仪（购自北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（购自美国eAlpha Innotch公司）。

1.2 临床样本

200例乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝外周全血样本由广州达安临床检验中心有限公司提供。

1.3 引物与探针

根据NCBI数据库提供的CYP3A5*3（rs776746）等位基因序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？do_not_redirect&rs=rs776746）及内参基因GAPDH的序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AY340484.1？report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=86&RID=M24C6HSE01N；GeneBank序列号：AY340484.1），采用Primerpremier5.0设计Taqman荧光PCR特异性扩增引物和探针，产物长度为80～150bp左右。为了提高ARMS-PCR引物的特异性，在CYP3A5*3和CYP3A5*1检测上游引物3′端SNP位点的临近位置引入错配核苷酸，如表1中加粗斜体字母所示。检测CYP3A5*3等位基因的Taqman探针5′端采用FAM荧光报告基团进行标记，3′采用BHQ1荧光淬灭基团进行标记。检测内参基因GAPDH的Taqman探针5′端采用VIC荧光报告基团进行标记，3′端采用BHQ1荧光淬灭基团进行标记。同时采用Primer premier 5.0设计CYP3A5*3的金标准Sanger测序引物，产物长度为300～400bp。引物和探针均由上海生工生物股份有限公司合成。具体序列特征和探针标记见表1。

1.4 全血样本基因组DNA提取

采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法），按试剂盒说明书进行操作。提取后的核酸置于-20℃冰箱中保存，并通过分光光度计测定其浓度。

1.5 Taqman荧光ARMS-PCR法检测CYP3A5*1和CYP3A5*3体系的建立

1.5.1CYP3A5*1PCR反应体系

25μLCYP3A5*1PCR反应体系包含0.1μLCYP3A5*1上游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用下游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用探针（25μmol/L）、0.1μLGAPDH上游引物（50μmol/L）、0.1μLGAPDH下游引物（50μmol/L）及0.1μLGAPDH探针（25μmo l/L）。12.5μL2×Hot-Start Taq Master Mix、5μL DNA模板（分别为CYP3A5*1/*1型人工合成质粒，CYP3A5*3/*3型人工合成质粒，人类基因组DNA），6.9μL灭菌蒸馏水。反应扩增条件：95℃3min；94℃15s，55℃35s；40个循环。

表1 引物及探针序列表Table1 Sequences of primers and probes

1.5.2CYP3A5*3PCR反应体系

25μLCYP3A5*3PCR反应体系包含0.1μLCYP3A5*3上游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用下游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用探针（25μmol/L）、0.1μLGAPDH上游引物（50μmol/L）、0.1μLGAPDH下游引物（50μmol/L）及0.1μLGAPDH探针（25μmo l/L）。12.5μL2×Hot-Start Taq Master Mix、5μL DNA模板（分别为CYP3A5*1/*1型人工合成质粒，CYP3A5*3/*3型人工合成质粒，人类基因组DNA），6.9μL灭菌蒸馏水。反应扩增条件：95℃3min；94℃15s，55℃35s；40个循环。

1.5.3CYP3A5*1和CYP3A5*3测序体系的建立

25μL PCR反应体系包含0.1μLCYP3A5测序上游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5测序下游引物（50μmol/L）、12.5μL 2×Taq PCR Master Mix、5μL DNA模板（分别为CYP3A5*1/*1型人工合成质粒，CYP3A5*3/*3型人工合成质粒，人类基因组DNA）、7.3μL灭菌蒸馏水。反应扩增条件：95℃10min；94℃15s，60℃30s，72℃30s；40个循环。扩增结束后，取5μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，并在凝胶成像系统中拍照。将剩余PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，采用Bio-edit分析软件比对分析测序结果与目的序列的一致性。

1.6 全血临床样本检测

采用本研究所建立的体系对200例全血临床样本进行PCR检测及测序验证，分析两种方法的一致性，统计分析CYP3A5*3基因多态性的分布。

2 结果

2.1 Taqman荧光ARMS-PCR法检测CYP3A5*1、CYP3A5*3体系的建立

配制CYP3A5*1检测体系，对CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型人工合成质粒及携带CYP3A5*1型人类基因组DNA进行检测。检测CYP3A5*1/*1型人工合成质粒，FAM通道扩增曲线呈S型，曲线光滑，Ct值＜35，VIC通道无明显扩增曲线（图1A）；检测CYP3A5*3/*3型人工合成质粒，FAM和VIC通道均无明显扩增曲线（图1B）；检测10ng/μLCYP3A5*1/*3型人类基因组DNA，FAM通道和VIC通道扩增曲线呈S型，曲线光滑，Ct值为28左右（图1C）。

配制CYP3A5*3检测体系，对CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型人工合成质粒及CYP3A5*1/*3型人类基因组DNA进行检测。检测CYP3A5*1/*1型人工合成质粒，FAM和VIC通道均无明显扩增曲线（图2A）；检测CYP3A5*3/*3型人工合成质粒，FAM通道扩增曲线呈S型，曲线光滑，Ct值＜35，VIC通道无明显扩增曲线（图2B）；检测10ng/μLCYP3A5*1/*3型人类基因组DNA样本，FAM通道和VIC通道均有明显扩增曲线，VIC通道扩增曲线呈S型，曲线光滑，Ct值为28左右（图2C）。

2.2 CYP3A5测序PCR扩增体系的建立

配制CYP3A5测序PCR反应体系，对CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型和人类基因组DNA进行检测。PCR扩增完成后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统进行拍照，根据有无条带，条带大小初步筛选出PCR扩增体系，结果如图3所示，扩增条带为300bp左右，与目的片段大小一致。将条带大小一致的剩余反应产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。Bio-edit比对分析测序结果与目的序列一致，测序峰图良好，各碱基信号值较强，多态性位点及临近片段无杂峰、套峰等现象，且背景信号较低（图4），表明CYP3A5测序PCR体系良好。

图1 CYP3A5*1反应体系检测结果Figure1 Detection results of CYP3A5*1 reaction system

图2 CYP3A5*3反应体系检测结果Figure2 Detection results of CYP3A5*3 reaction system

图3 CYP3A5 PCR产物电泳图Figure3 Agarose gelelectrophoresis of CYP3A5 PCR products

图4 CYP3A5 PCR产物测序峰图Figure4 Sequencing peakmap of CYP3A5 PCR products

2.3 临床样本检测及多态性分析

提取200例外周血样本基因组DNA，进行CYP3A5基因多态性检测，并采用金标准sanger测序法进行验证。结果显示，本研究建立的基于Taqman荧光ARMS-PCRCYP3A5*1和CYP3A5*3体系与测序法有较好的一致性，所有样本型别检测结果完全一致。具体型别分布为：CYP3A5*1/*119例（9.5%），CYP3A5*1/*362例（31%），CYP3A5*3/*3119例（59.5%），CYP3A5*3等位基因突变频率为75%。

3 讨论

CYP3A5基因多态性是造成个体间CYP 3A活性差异（相差约l0～40倍）及CYP3A代谢药物疗效和个体间不良反应差异的最重要因素[10-12]。大量研究发现，CYP3A5*3基因多态性是影响器官移植受体他克莫司（FK506）血药浓度的重要因素[13-15]。CYP3A5在他克莫司的代谢中起重要作用，其活性降低可导致他克莫司的血药浓度升高，不良反应增加。同时研究发现携带野生CYP3A5*1型患者需要比CYP3A5*3/*3型高2倍的剂量才能达到目标血药浓度[16-17]。

目前常用的用于检测CYP3A5基因多态性的方法包括DNA测序法（DNA sequencing analysis）、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、高效液相色谱分析（High performance liquid chromatography，HPLC）、毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）等，但这些方法均存在操作复杂、耗时较长、成本高、检测灵敏度低且容易造成假阳性或假阴性等弊端[18-20]。另外，传统ARMS-PCR也被广泛用于CYP3A5*3基因多态性检测，虽然特异性较强，检测灵敏度较高，但检测过程涉及到琼脂糖凝胶电泳等过程，操作复杂且需要接触到EB染料等强致癌物，对人造成一定危害[21]。本研究基于Taqman荧光ARMSPCR技术，设计特异性引物，并在靠近引物3′端不同位置引入错配碱基，筛选出最优引物，对靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品CYP3A5多态性的检测。其检测过程简单快捷，仅需1个小时即可完成所有检测，有效避免接触EB染料，同时保证较高特异性和灵敏度。在200例临床样本检测中，本方法检测结果和金标准sanger测序法一致性为100%，表明其准确性较高。

因此，本研究建立的基于Taqman荧光ARMSPCR技术检测CYP3A5基因多态性方法具有较高的准确性、特异性和灵敏度，且其操作简便快速、自动化程度高、结果判读直观，在指导器官移植患者服用他克莫司药物治疗的起始剂量中具有良好的临床应用前景，便于临床的推广。