环境DNA及其在水生生物多样性调查中的应用

葛玉双，闫永斌，程起群

(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 200090； 2. 上海海洋大学海洋科学学院, 上海 201306)

生物多样性是人类赖以生存和发展的物质基础。随着经济和社会的飞速发展，生物多样性遭遇了空前的危机和挑战。以长江为例，由于水利工程建设、环境污染、酷捕滥渔等因素的影响，长江水生生物多样性急剧衰退，青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)四大家鱼卵苗发生量由20世纪60年代的1 200×108粒(尾)下降到目前的不足10×108粒(尾)；鲥(Tenualosareevesii)、鯮(Luciobramamacrocephalus)难觅踪迹；中华鲟(Acipensersinensis)连续数年监测不到自然繁殖，白鳍豚(Lipotesvexillifer)则已功能性灭绝；而就在最近，处于长江食物链顶端的、世界上最大的淡水鱼之一的白鲟(Psephurusgladius)，已宣布灭绝[1]。

开发快速、有效的生物多样性监测工具来监测生物多样性的波动，是科学制定保护和管理策略的基础。传统调查方式在监测水生生物多样性、制定管理和保护措施中发挥着重要的作用，但也存在诸多不足，如耗时长、准确度低、依赖专家经验、对资源和环境不够友好、稀有种调查难等。环境DNA(environmental DNA，eDNA)调查法是一种新型的水生生物多样性检测方法，克服了传统调查法的弊端。近年来，该方法得到了较为广泛的应用。本文从环境DNA特性、检测方法及其在水生生物多样性中的应用等方面进行综述，以期为进一步开展环境DNA检测提供有益的借鉴。

1 环境DNA的特性

eDNA是指生物释放到水、空气及土壤等环境中的短DNA片段。这些eDNA可能来源于生物体表皮细胞经皮肤、尿液、粪便、粘液等释放到环境中的胞内DNA，或者是细胞死亡后裂解释放到环境中的胞外DNA[2]。

1.1 环境DNA的大小

eDNA的直径变化幅度较大，有大于180 μm的，也有小于0.2 μm的，但大多数小于0.2 μm[3]，其大小可能与生物种类不同有关。PAUL等[4]根据eDNA是否能够通过0.2 μm孔径的滤膜，把eDNA分成2类：微粒DNA(直径大于0.2 μm)和溶解DNA(直径小于0.2 μm)，其中直径大于0.2 μm的微粒DNA大部分为浮游生物，小于0.2 μm的溶解DNA包含病毒。而TURNER等[3]的研究发现鲤(Cyprinuscarpio)的eDNA直径多为1 μm～10 μm。

1.2 环境DNA的存在方式

eDNA的存在方式包括：微囊泡包裹的eDNA、结合其他物质的eDNA和自由溶解分子的eDNA[5]。目前以自由溶解分子形式存在的eDNA，尚不清楚是否能够抵御环境损伤，延缓eDNA降解，其他两种方式均有其特有的延缓eDNA降解的结构。水环境中存在一种类似包裹尿液和血清的微囊泡，该结构可有效地减少胞外环境因子对eDNA的影响；eDNA也能够结合环境中的物质，例如，土壤能够在一定程度上减缓eDNA的降解[6]。

1.3 环境DNA的持久性

除去其来源后，eDNA在环境中存在的时间称为eDNA的持久性[7]。eDNA的持久性因环境而异，从几小时到几万年不等[8-11]。在水环境中，海水中的北美三刺鱼(Gasterosteusaculeatusaculeatus)eDNA仅能存在21 h[8]，海水种类中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)以及淡水脊椎动物的eDNA能存在1个月左右[9-10]；在土壤中，存在着40～50年前的植物eDNA[11]；在永久冻土中，发现了40 000年前物种的eDNA[12]。

影响eDNA持久性的因素可分为内因和外因。其中，内因包括eDNA片段的长度、序列、构象等。研究表明：短片段的eDNA比长片段的eDNA更为稳定[13]；线性的eDNA和螺旋化的eDNA的持久性不同，可能是核酸酶酶解二者的速率不同[14]。外因包含生物酶解、物理磨损、化学腐蚀等，例如，环境微生物DNA酶酶解eDNA[6]、高温增加DNA分子变性的概率或加速酶解eDNA[13]、高盐、缺氧影响eDNA构象和稳定性，同时也可能限制核酸外切酶的活性[8]。

2 环境DNA检测的主要步骤

eDNA检测要经过样品获取、样品处理、eDNA的提取、引物设计、PCR扩增以及测序等步骤，如图1：

2.1 样品获取

在取样规程中，样本体积的大小视实际情况而定，通常物种密度越高，取样体积越小。人工条件下一般养殖密度较高，则取样的体积较小，15 mL最为常见；野外环境中一般物种密度较小，则取样体积较大，1 L最为广泛。总体而言，根据1987—2018年来关于水生生物eDNA研究的文献(如图2，文献来源为在NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)上以(((environmental DNA) OR eDNA) AND water samples) NOT review为检索词获得的相关文献)可知，水样取样体积大小广泛，从10 mL到500 L不等，但大多数取样体积为15 mL、250 mL、500 mL、1 L、2 L。

2.2 样品处理

对于水样的保存，一般选择冷冻或化学保存。冷冻条件一般为-20℃以下；化学保存是利用化学物质对水样进行保存，一般用3 mol·L-1的醋酸钠和100%或95%的乙醇混合液混合水样。

对于水样的处理，主要有离心和过滤2种方法。离心是让样本中的eDNA沉降，从而浓缩eDNA[15]；过滤是将水样中的eDNA截留在滤膜上，从而实现对样本体积的浓缩[16]。目前应用最多的方式为过滤。通常选用水系滤膜进行eDNA过滤，滤膜的材质多样，如聚碳酸酯膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和尼龙膜等；滤膜的孔径不一，例如，0.2 μm, 0.22 μm, 0.45 μm等，如图3，数据来源来源同图2。滤膜的材质、孔径会影响eDNA检测的结果，需谨慎选用。例如，在研究中国对虾(F.chinensis)时发现，直径为0.45 μm，材质为玻璃纤维膜的滤膜通透性最佳[16]。

2.3 eDNA提取

环境样本中的eDNA含量少、成分复杂，eDNA的提取难度高于组织DNA的提取。当前，eDNA的提取方法还没有像组织DNA的提取方法那样成熟，发展出多种提取方法。eDNA的提取方法总体上分为3类，即传统提取法、DNA试剂盒提取法以及两者结合的方法。目前用于eDNA提取的试剂盒有普通DNA提取试剂盒(如DNeasy血液和组织试剂盒)和专有eDNA提取试剂盒(例如，PowerWaterTMDNA提取试剂盒、PowerMaxTM土壤DNA提取试剂盒)。目前尚未发现关于普通DNA提取试剂盒和专有eDNA提取试剂盒比较的文献，但专有eDNA提取试剂盒价格比普通试剂盒昂贵。这可能是因为样品中eDNA含量少，且存在杂质及污染物等，专有eDNA提取试剂盒可以排除杂质及污染等干扰，得到质量更好、产量更高的eDNA。eDNA提取完成后，一般放在放4℃或-20℃保存。

2.4 设计引物

扩增遗传标记的引物可分为通用引物和特异性引物，引物设计的第1步是获得目标物种的线粒体DNA序列，可通过查找NCBI数据库或测序目标物种获得DNA序列；第2步是根据调查目的和引物设计原则，利用引物设计软件设计引物。如果用于物种监测，需要设计针对研究对象的特异性引物[17]；如果用于生物多样性评估，则需要设计通用引物[18]。当前设计引物的软件有Primer Premier，Oligo7， Beacon Designer，在线的NCBI Primer-Blast，Primer3 Plus，Bath Primer 3.0，The PCR Suit，Primerbank和PrimerX等。

2.5 PCR扩增

水样本的扩增方式有常规PCR扩增和实时荧光定量PCR(qPCR)。常规PCR可利用通用引物扩增多种生物的目的片段；qPCR可利用特异性引物定性扩增特定物种的目的片段，同时能定量分析该目的片段的含量。

在PCR扩增过程中，PCR的循环数大多在30至55之间(如图4，数据文献来源同图2)，和普通DNA扩增循环数并无差异。为了提高高通量测序质量，消除单次PCR带来的误差，常将每个样品进行多管重复PCR扩增，重复次数从3个[19]到12个[20]不等。但近来有研究表明，单次PCR得到的Reads显著高于3次PCR的混合[21]。

PCR扩增的结果以阴性、阳性记录。阴性表明环境样品中不存在目标DNA，阳性则表明环境样品中存在目标DNA。在PCR扩增过程中需要设置阴、阳性对照，以此来排除假阳性与假阴性结果。

2.6 测序及数据分析

通用引物扩增eDNA样品得到生物的DNA序列，这些混合DNA经测序、比对、筛选等最终确定生物种类。新一代测序仪平台可对混合的扩增片段进行测序。较早开始的测序平台是焦磷酸测序[22]，随着技术的发展，出现了测序能力更强，成本更低的新一代测序平台，如Ion Torrent[23]和Illumina[24]平台。测序完成以后，进行原始序列处理、OTU分类和注释及多样性分析等，最终完成实验。

3 环境DNA检测技术在水生生物多样性调查中的应用

不同于宏观的传统调查方式，从微观的分子生物学视角出发，eDNA检测技术的出现为水生生物多样性调查提供了一种崭新的方法，应用十分广泛。当前已应用于古生物群落演替重现、物种监测及预测、生物多样性调查和种群动态研究等方面。

3.1 古生物群落演替重现

温度影响eDNA的持久性，冰冻条件可保存eDNA上万年，这一特点为重现古生物群落演替提供了条件。根据eDNA检测，西伯利亚冻土中的真菌和植物多样性在最后一次冰期前后发生了变化[25]。eDNA检测表明更新世和全新世的过渡期大量植被发生了变化，且这些植被演替对巨型动物的灭绝产生了影响[26]。

3.2 物种监测及预测

eDNA检测技术已应用于入侵种、濒危种、稀有种等诸多水生物种的检测中。生物入侵会造成一系列危害，如造成生态系统功能损伤、生态系统退化、生物多样性丧失等重大问题，因此，需要及早发现并采取有效措施遏制。eDNA检测可及时、准确地监测出水生生态系统中的生物入侵种。现已在诸多水生入侵种的监测中得到成功应用，例如美国牛蛙(Ranacatesbeiana)[19]、鲤(C.carpio)[27]、蜗牛(Potamopyrgusantipodarum)[28]、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[29]等。

调查稀有、濒危物种一直是生物调查的难点。传统的调查方法精确度偏低、数据误差偏高且对调查物种不友好，这些调查方式在某些调查中可能起不到物种调查的作用，甚至会破坏种群数量，加速物种衰退。被称为非入侵式调查的eDNA检测能够弥补传统调查方式的不足，且发现数量极少的物种，如eDNA检测重新发现消失多年的巴勒斯坦油彩蛙(Latonianigriventer)，还发现了该物种的主要分布区域[30]。此外，eDNA检测还成功预测美国大鲵(Cryptobranchusalleganiensis)[31]，大凤头蝾螈(Trituruscristatus)[32]等濒危动物。

3.3 生物多样性调查

传统的生物多样性调查法耗时、费力，且对环境有一定的破坏力及杀伤力，eDNA检测法省时节力，且对环境友好。eDNA检测生物多样性已应用于江河湖海的许多地方，其调查结果比传统方式调查结果更为全面。在丹麦海洋鱼类多样性调查中，eDNA检测调查到传统调查方式没有调查到的罕见鱼类[8]；在美国上百个池塘、小溪、河流的生物多样性调查中发现多种两栖动物、鱼类、哺乳动物、昆虫和甲壳类动物[33]；在英国湖泊鱼类多样性调查中发现，eDNA检测到了历史记录的大部分鱼类，而传统方式仅捕捞到4种[34]；在中国东黄海渔业资源调查中发现了100多种鱼类，比传统捕捞方法获得的种类多[35]。

3.4 种群动态研究

eDNA检测已在多种生物的多样性调查中发挥作用，但在生物量估测上却困难重重。虽然eDNA受到多种因素的影响，但早在多年前，TAKAHARA等[36]和EICHMILLER等[37]就发现鲤鱼的生物量与eDNA的浓度呈正相关，并给出了相应的模型，以期预测种群的分布与丰度。更多的物种生物量与eDNA浓度的关系也得到了研究，如贻贝[38]，但该方法尚未得到应用。因此，利用eDNA检测估测生物量，进而检测种群动态这条道路还很曲折。

4 环境DNA检测的不足与展望

从微生物、植物到动物，eDNA检测的对象不断丰富；从检测污染、保护生物多样性到重建古生物生态系统，eDNA检测的应用范围不断扩大。虽然eDNA检测发展十分迅速，应用也更加广泛，但仍存在诸多不足：

(1)eDNA遗传标记的局限性。水生动物eDNA检测的遗传标记主要是线粒体DNA，虽然线粒体DNA具有拷贝数多，容易被检测等优点，但线粒体DNA是母系遗传，作为分子标记，仅能追踪到特定种群中部分基因位点，无法区分杂种及其母本物种[39]。可将线粒体遗传标记和核遗传标记等结合使用；或者寻找新的遗传标记，克服母系遗传的不足。

(2)eDNA检测中通用引物的局限性。在生物多样性调查及古生物群落重现时，掌握生物种类信息是完成调查任务的前提。eDNA检测中，利用通用引物进行PCR扩增获得物种种类信息，对通用引物的要求是扩增物种种类全、分辨率高，但目前还没有十分完美的通用引物。以鱼类通用引物为例，虽然能够扩增出90%的鱼类线粒体DNA12S序列，但其分辨率较低，种属区分度有限[40]。此外，还会扩增出非鱼类物种，如鸟类，说明该鱼类通用引物的特异性不够[8]，给数据的分析增加了难度。因此，需要开发新的扩增目标生物种类齐全、分辨率满足需要、特异性合适的新型引物。

(3)eDNA检测易受到环境污染的影响。样品本身可能含PCR抑制剂，如海水样品中的高盐[41]、淡水样品中的腐殖酸[42]，这些PCR抑制剂可能造成假阴性结果。样品从采集到运送至实验室是一个路途远、耗时长的过程，这个过程大大增加了样品的污染机率。此外，环境样品在实验室中经过DNA的提取，PCR扩增，高通量测序等一系列处理，整个过程的实验操作步骤繁琐、使用试剂纷杂，增加了eDNA检测无污染要求的难度。

(4)数据库中生物信息学资料尚不完备。在中国东黄海鱼类资源调查时发现，eDNA检测技术能够检测到大部分传统方法捕捞的鱼类，而像小带鱼(Eupleurogrammusmuticus)、细条天竺鲷(Apogonlineatus)、斑翅虎鲉(Minouspictus)等鱼类则无法检测到，其原因可能是数据库不全，通过高通量测得的数据无法比对到这些物种[35]。完善数据库信息，可提高eDNA检出率。

eDNA检测技术虽然在物种多样性调查、稀有物种及濒危物种保护等方面起到非常重要的作用，但还存在以上等诸多不足。传统调查方式虽然没有eDNA检测方法高效，但也有其独有的优点，如获得更多生物相关信息。在进行某河段生物多样性调查时，除了获得生物多样性的情况外，还能了解到物种性别、个体长度、重量及健康状况等。总的来说，传统调查方式和eDNA检测技术这两种调查方法各有所长，在实际调查中，不能只依赖于其中一种，而是应将传统调查方式和eDNA检测技术相结合，这样才能更全面、更高效地监测水生生物多样性，在水生生态文明建设中发挥更积极的作用。