红曲霉液态发酵产色素条件优化

□ 郭 航 吉林工程职业学院 粮油食品学院

红曲霉（Monascus purpureus Went.）又叫红曲、红糟、红大米，广泛存在于树木、土壤和堆积物等。红曲色素是以红曲霉为原料通过现代科技手段提取的一种天然色素，具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、抑制突变等功效。在食品工业被广泛应用于肉制品、调味品、腌制品、酒类及焙烤类食物中。近年来，红色食用色素如甜菜红、红曲红和胭脂红被允许添加到食品中。相对甜菜红和胭脂红，红曲红色素可用发酵法生产，通过优化菌种发酵条件使其产色素量增加，使红曲红色素的开发利用前景更为广阔。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄糖、玉米粉、NaNO3、大豆粉、 尿 素、K2HPO4、FeSO4、KCl、MgSO4·7H2O、琼脂、乳酸、甘油、L—谷氨酸钠、无水乙醇、NaCl与红曲霉。

1.2 仪器与设备

霉菌培养箱（MJP—150）、显微镜（XSZ—480AT）、 电 热 恒 温 水 浴锅（DK—8B）、定时双向磁力搅拌器（JB—1）、恒温培养振荡器（HZQ－R）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG—9140A）、高压灭菌锅（YXQ—LS—30S）、阿贝折光仪（BM—2WAJ）、超声波细胞破碎仪（NJL07—5）、分光光度计（722s）、低速离心机（TG—16—WS）和超净工作台（ZHJH）。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制

1.3.1.1 种子培养基

玉米粉5%、NaNO33%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 1.5%、pH5.4，高压蒸汽灭菌15 min（0.1 MPa）。从固体斜面培养基上取适量的红曲霉菌种，添加到种子培养基中。装液量100 mL，摇床震荡培养，30 ℃，170 r/min，培养7 d。

1.3.1.2 红曲霉液体培养基

葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 用 乳酸将 pH调为5.4，高压蒸汽灭菌15 min（0.1 MPa）。

1.3.2 红曲霉液态发酵产色素实验

在红曲霉培养基配方研究的预实验中发现碳源、氮源、pH值、甘油和L—谷氨酸钠显著影响红曲霉产色素。因此，选择研究碳源、氮源、pH值、甘油和L—谷氨酸钠这5个因素作为研究对象进行单因素实验，确定最终的培养基配方。

实验条件：30 ℃，170 r/min，摇床震荡培养，每24 h测定一次吸光度，进而判断出红曲霉的色素产量，直到吸光度值不再增加。

1.3.3 发酵液色价的测定

吸取发酵液1 mL加入装有9 mL 75%乙醇溶液（pH6.0～7.0）的试管中，摇匀，静置15～20 min。移液管吸取1 mL上清液到另一试管中，加入9ml 75%乙醇溶液稀释，用75%的乙醇溶液作为空白对照，用1 cm比色皿分别在410 nm和510 nm下测定吸光值（A）值。若吸光值小于等于0.8则吸光值乘以发酵液的稀释倍数即为发酵液的色价（U/mL），若吸光值大于0.8，则分光光度计测量出的数据不准确，需要对发酵液进行进一步的稀释再测量，直至吸光值小于等于0.8，吸光值乘以发酵液的稀释倍数即为发酵液的色价（U/mL）[1]。

2 结果与分析

2.1 碳源对红曲霉产色素的影响[2]

选择NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，用乳酸将pH调为5.4，改变碳源，分别添加玉米粉3%、葡萄糖3%、淀粉3%、麦芽糖3%，并进行色价测定，结果如图1所示。

图1 碳源对红曲霉产色素影响图

由图1可知，使用玉米粉作碳源时，红曲霉产色素量最大，颜色深；使用淀粉时，红曲霉产色素量较大，颜色较深；当使用麦芽糖和葡萄糖作为碳源时，红色素产量低并且产色素慢。因此，葡萄糖和麦芽糖不是红曲霉的良好碳源，培养红曲霉时应尽量选用玉米粉或者淀粉作为红曲霉的碳源。红曲霉能良好的利用玉米粉的原因是玉米粉含有某些天然物质，有利于红曲霉的生长[3—4]。由此分析，玉米粉和淀粉是红曲霉的良好碳源，培养红曲霉应选用玉米粉或淀粉，考虑到成本，最终选择玉米粉。

2.2 氮源对红曲霉产色素的影响

选择葡萄糖3%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，用乳酸将pH调为5.4，改变氮源，分别添加NaNO30.2%、大豆粉0.2%、NaNO30.2%、尿素0.2%，并进行色价测定，结果如图2所示。

由图2可知，使用大豆粉作为氮源，红曲霉产色素最高，色素的颜色深；使用尿素作为氮源，红曲霉几乎不产色素，培养基的颜色几乎不变，可以推断出红曲霉不能以尿素作为氮源[5]。由此可以推断，红曲霉易于利用有机氮，利用有机氮产生的红曲色素要多于利用无机氮产生的红曲色素[6—7]。即利用大豆粉产生的色素多于NaNO3。尿素在酸、碱、酶的作用下（酸、碱需加热）能水解生成氨和二氧化碳，二氧化碳不能被异养微生物利用。因此在氮源的选择上，大豆粉是红曲霉的良好氮源，培养红曲霉应选择大豆粉作为氮源。

2.3 pH对红曲霉产色素的影响

选择葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 改 变pH，分别为3.0、3.8、5.8、7.0与7.6，并进行色价测定，结果如图3所示。

由图3可知在pH值为3.8时培养红曲霉，红曲霉产色素最大，色素颜色最深；在pH值7.6时培养红曲霉，红曲色素产量较低，色素颜色很浅。由此可以看出，红曲霉宜在偏酸性的环境中生长。

图2 氮源对红曲霉产色素影响图

图3 pH对红曲霉产色素影响图

图4 甘油添加量对红曲霉产色素影响图

2.4 甘油对红曲霉产色素的影响

选择葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 用 乳酸将pH调为5.4，改变甘油添加量，分别添加1%、2%、3%、4%和5%，并进行色价测定，结果如图4所示。

由图4可知，适当添加甘油可以增加红曲霉色素的产量。当甘油的添加量为2%时，红曲霉产色素量最多，色素的颜色最深。当添加量大于或者低于这个值时，红曲霉产色素量都会受到一定的影响。甘油添加量过多后，可能会影响培养基的pH值，偏离红曲霉菌株的最适pH值，产色素量降低。因此，在保证培养基的其他条件都适合红曲霉菌生长的情况下，添加2%的甘油有利于红曲霉产色素。

2.5 L-谷氨酸钠对红曲霉产色素的影响

选择葡萄糖 3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 用 乳酸将pH调为5.4，改变L—谷氨酸钠添加量，进行试验，分别添加0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%L—谷氨酸钠，并进行色价测定，结果如图5所示。

图5 L-谷氨酸钠添加量对红曲霉产色素影响图

由图5可知，L—谷氨酸钠的添加量为0.1%时，红曲霉产色素量最大。原因可能是，谷氨酸钠添加到培养基中可以分离出Na+供红曲霉菌株利用。当L—谷氨酸钠的添加量超过0.1%时，红曲霉产色素量下降。这是由于当添加过多的L—谷氨酸钠时，会导致培养基的酸碱度呈中性或者偏碱性，不适于红曲霉菌株生长，生长缓慢，产色素量降低。因此，选择向培养基中加入0.1%的L—谷氨酸钠。

3 结论

本文对红曲霉液态发酵产色素培养基进行优化，结果表明玉米粉3%，大豆粉0.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH为3.8，甘油2%，L—谷氨酸钠0.1%，培养7～8天，红曲霉产色素最佳。培养基呈深红色，在510 nm下的色价为4.06 U/mL。