果胶酶法提取紫甘蓝花青素工艺条件研究

唐 功，何 敏，王仕英，嬴 河，郑贵凤，沙马尔的木，李毛卓改

（阿坝师范学院，化学化工与生命科学系，四川 汶川县水磨镇623003）

果胶酶法提取紫甘蓝花青素工艺条件研究

唐 功，何 敏，王仕英，嬴 河，郑贵凤，沙马尔的木，李毛卓改

（阿坝师范学院，化学化工与生命科学系，四川 汶川县水磨镇623003）

文章探索了果胶酶法提取紫甘蓝花青素的工艺条件.采用单因素试验和正交试验相结合的方法研究不同因素即pH值、酶解温度、酶解时间、酶量和料液比对花青素提取的影响.最佳提取条件是：加酶量0.7%、pH＝4、酶解时间是60min、料液比1︰10、酶解温度40℃.果胶酶法提取紫甘蓝花青素的色价是普通乙醇溶剂法提取的15倍，这为花青素提取技术的研究提供理论参数支持.

果胶酶；花青素；提取工艺

紫甘蓝俗称紫包菜，是结球甘蓝中的一个变种.它的叶片呈紫红色，表面有灰白色蜡粉，其中富含花青素，虽然它不是人体必需的营养素，但确是最常见的抗氧化物质之一［1］，对于预防衰老和相关的疾病很有帮助.各国学者对不同来源的植物原花青素进行研究，发现紫甘蓝中的花青素具有预防心脏疾病［2］、心血管疾病［3］、抗氧化［4］等功能，将其开发利用有可能成为一种有价值的天然色素资源.

目前，研究紫甘蓝花青素提取工艺的文献不多，大多采用传统的浸提法［5－6］、微波辐射法和超声波辅助法［7］.但是在天然食用色素提取中，由于天然色素一般在高温、强酸、强碱条件下发生变化或分解，而酶辅助提取技术具有专一性强、条件温和、反应过程容易控制［8］等众多优势，所以酶解法更适合于天然食用色素的提取.本试验主要研究的是果胶酶法提取紫甘蓝花青素最佳条件，包括pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间和料液比，为紫甘蓝花青素提取技术的研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫甘蓝：汶川县水磨镇农贸市场购买；试剂：果胶酶10u／mg，购于成都市科龙化工试剂厂；盐酸、无水乙醇（均为分析纯）.

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计、恒温水浴锅、电热恒温干燥箱、笔式酸度计、电子天平、离心机.

1.3 方法

1.3.1 紫甘蓝花青素提取液的制备

将购于市场的紫甘蓝放入80℃的恒温箱中进行24小时烘干→粉碎→加入提取液→调节pH值→加入果胶酶，电动搅拌辅助酶解60min→酶解液4 000r／min离心30min后抽滤取上清液→花青素提取液.

1.3.2 单因素试验

称取一定质量的紫甘蓝粉末于三角瓶内，调节pH值后加入果胶酶，放入水浴锅中.在一定温度下搅拌一段时间后加入乙醇浸提，然后将瓶内溶液以4 000r／min转速离心30min，取部分所得上清液，在530nm处测定其吸光度，进而计算花青素色价.分别考察pH值、酶解温度、加酶量、底物浓度、酶解时间对紫甘蓝花青素提取效率的影响.

1.3.3 紫甘蓝花青素含量的检测

空白对照的制备：相应体积的蒸馏水.

参照杨朝霞［9］的色价测定方法，以上述空白样做空白对照，在波长530nm下对花青素溶液进行吸光度检测，并计算色价.

色价表达式为：E1cm1%＝（A／W）×K.

式中：E1cm1%为色价；A为吸光度；W为样品质量／g；K为稀释倍数.

1.3.4 正交试验

在单因素试验的基础上，采用L16（45）正交试验优化提取条件，因素和水平见表1.

表1 果胶酶提取条件正交水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

固定条件为酶解pH＝4，酶解温度为40℃，加酶量0.7%，料液比为1︰10，酶解时间60min.在其他条件不变的情况下分别考察酶解pH值、酶解温度、加酶量、料液比、酶解时间对花青素提取效率的影响，根据花青素提取液的色价大小确定最佳提取条件.

2.1.1 pH值对花青素色价的影响

酶解pH值梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0，酶解后测其分光光度值，并计算色价.根据色价大小确定最佳酶解pH值，结果如图1所示.

图1 pH对酶解提取紫甘蓝花青素色价的影响

由图1可知，紫甘蓝花青素溶液色价随pH值增大而减小.在pH＝4时有最大的值，因此pH值的升高不利于酶解提取紫甘蓝花青素.pH值对酶解助提取效率影响主要体现在两个方面：一方面是pH值的大小影响紫甘蓝花青素在水中的溶解度；另一方面是pH值的大小影响果胶酶酶解紫甘蓝细胞壁，从而影响花色苷的流出.

综上所得，在pH＝4时花青素色价最大，此时为最佳提取的pH值.

2.1.2 酶解温度对花青素色价的影响

将酶解温度梯度设置为20℃、30℃、40℃、50℃，酶解后测其分光光度值，并计算色价，根据色价大小来确定最适酶解温度，结果如图2.

图2 酶解温度对酶解提取紫甘蓝花青素色价的影响

由图2知，从总体趋势来看，紫甘蓝花青素色价在一定范围内随温度的升高而升高，直到酶的活性达到最大，但超过40℃时色价随温度的升高反而降低.因为酶的活性不但不会升高反而会下降，最后导致酶失活.由图2可知，温度40℃为提取的最适温度.

2.1.3 加酶量对花青素色价的影响

将加酶量的梯度设置为0.2%、0.7%、1.2%、1.7%，酶解后测其分光光度值，并计算色价，根据色价大小来确定最佳加酶量，结果如图3.

图3 加酶量对酶解提取紫甘蓝花青素色价的影响

由图3可知，随着酶量的增加色价不断增大，当酶量达到0.70%后色价增大不明显.但当酶解到一定程度时，随着酶量增大，紫甘蓝的细胞壁破坏就越厉害，也就越不利于花青素的提取，因此确定最佳的加酶量为0.70%.

2.1.4 料液比对花青素色价的影响

将料液比的梯度设置为1︰5、1︰10、1︰15、1︰20，酶解后测其分光光度值，并计算色价，根据色价来确定最佳料液比，结果如图4.

图4 料液比对酶解提取紫甘蓝花青素色价的影响

由图4可知，料液比在1︰10时色价最高，之后随着料液比的增加花青素的色价反而下降.这表明提取剂的增加不利于酶解提取花青素，根据实验结果确定酶解料液比为1︰10.

2.1.5 酶解时间对花青素色价的影响

将酶解时间梯度设置为30min、60min、90min、120min，酶解后测其分光光度值，再计算色价，根据色价大小来确定最佳酶解时间，结果如图5.

图5 酶解时间对酶解提取紫甘蓝花青素色价的影响

由图5可知，在60min的时候色价是最高的.随着酶解时间的延长，花青素色价呈现下降趋势.因为时间过长，酶解反应逐渐结束，所以色价降低.由图5可知，在提取时间为60min时色价最高，可以确定为最佳酶解提取时间.

表2 果胶酶助提取条件正交试验结果

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上进行正交试验.根据表1设置的条件进行酶解提取，表2为果胶酶助提取条件正交试验结果.

根据表2判断，5个因素对紫甘蓝花青素色价的影响顺序为：C＞A＞E＞D＞B，最优提取条件为A1B3C2D2E2，即酶解提取pH＝4、酶解温度为40℃、加酶量为0.7%、料液比为1︰10、酶解时间为60min.

通过SPSS13.0对正交试验结果进行方差分析，结果如表3.

表3 正交试验方差分析

由表3可见，5因素中对试验有显著影响的是加酶量和pH值，较为显著影响的是酶解时间、料液比，不显著的是酶解温度.影响顺序与表2相同，即最佳提取工艺为A1B3C2D2E2.

2.3 酶法提取花青素的验证试验

果胶酶优化提取与同条件乙醇溶剂法提取结果比较：在相同条件下（pH值为4、料液比为1︰10、提取温度为40℃、提取时间为60min）分别在果胶酶酶解和乙醇溶剂中进行试验，做2次验证试验，在530nm处测取吸光度并计算出花青素的色价，结果如表4.

表4 验证试验结果

由表3可见，酶解法提取的色价是溶剂法提取的15倍.因此，用果胶酶法提取紫甘蓝的花青素可以减少溶剂污染，同时可提高提取效率，同传统溶剂法相比能够节约资源，实现工业化的可行性.

3 结论

单因素试验与正交试验结果表明，果胶酶法提取紫甘蓝中花青素的最佳工艺条件为加酶量0.7%、pH＝4的酸性乙醇、酶解时间是60min、料液比1︰10、酶解温度是40℃.果胶酶法提取紫甘蓝花青素色价是溶剂法提取的15倍.通过对比试验证明，酶解法提取紫甘蓝花青素既可以减少溶剂污染，同时又提高了提取的效率，它为紫甘蓝花青素的提取提供了一条新途径，对工业化生产具有一定的参考价值，为紫甘蓝色素的开发利用提供了参考.

［1］Takuro K，Kciko M，Kaoru N，et al.Increase of antioxidative protentian of rat plasma by oral administration of proanthocyanidin－rich extract from rape seeds［J］.Agric Food Chen，1999，47（5）：1892-1897.

［2］Sanoner P，Guyot S，Marnet N，et al.Polyphenol profiles of French cider apple varieties（Malus domestica sp.）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（12）：4847-4853.

［3］Frankel E N，Kanner J，et al.Inhibition of oxidation of humanlow-density lipoprotein by phenolic substances in red wine［J］.Lancet，1993，341（8843）：454-457.

［4］Jorge M，RicardoI D，Jacques R，et al.Procyahidins dimmersand trimers from grape seeds［J］.Phytochemistry，1991，30（4）：1259-1264.

［5］王燕霞.传统水浴提取紫甘蓝红色素工艺研究［J］.食品研究与开发，2007，28（1）：119-122.

［6］张玉敏，郭艳华，陈义锋.紫甘蓝色素最佳提取工艺条件的研究［J］.华中师范大学学报（自然科学版），2006，40（2）：209－212.

［7］王欢.紫甘蓝色素最佳提取工艺条件的研究［J］.食品研究与开发，2011，32（12）：229-233.

［8］程贤，毕良武，赵振东等.酶辅助提取技术在天然产物提取中的应用研究进展［J］.生物质化学工程，2016，50（03）：71-75.

［9］杨朝霞.紫甘薯花色苷色素提取纯化工艺研究及组分分析［D］.青岛：青岛大学，2004.

Study on Extraction Conditions of Pectinase Anthocyanins of Purple Cabbage

TANG Gong，HE Min，WANG Shi－ying，YIN He，ZHENG Gui-feng，SHA Ma-er-di-mu，LI Mao-zhuo-gai
（Department of Chemistry and Life Science，Aba Normal University，Wenchuan 623002，China）

Objective The present study aimed to explore the extraction of purple cabbage anthocyanin with a pectinase method.Methods The single factor test and orthogonal test were used to study the effects of different factors，namely pH value，temperature，time，pectinase amount and solid-liquid ratio on the extraction of anthocyanins.Results The optimal extraction conditions included 0.7%pectinase，pH＝4，enzymatic hydrolysis time of 60minutes，1：10solid-liquid ratio，the enzyme hydrolysis at 40℃temperature.Conclusion The color value of purple cabbage anthocyanin with pectinase extraction was 15times mire than that of the ordinary extraction with ethanol solvent method.Our results probably provided some theoretical and experimental support for the extraction technology of anthocyanins.

Pectinase；Anthocyanin；Extraction technology；

TQ461

A

1009-2102（2016）03-0001-06

2016－08－02

四川中小学教师专业发展研究中心（TDTR2016－015），校级教改课题（重点）（JXGG2015－03）.

唐功（1970—），男，甘肃定西人，硕士，副教授，主要从事生物化学教学与研究.