文山三七块根的植物组织培养研究

李 涛，李小清，张智慧，李 燕，王燕新，田 立，廖圆圆，李增政，刘俊林

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

文山三七块根的植物组织培养研究

李 涛，李小清，张智慧，李 燕，王燕新，田 立，廖圆圆，李增政，刘俊林＊

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

选择云南文山三七块根为外植体，采用全面实验法或正交实验法，研究组织培养过程中外植体最佳表面消毒方案和最佳愈伤组织诱导、分化生芽、生根方案.试验结果表明，三七块根最佳表面灭菌方案为75%乙醇消毒10s，再用2%次氯酸钠溶液消毒15min；最佳愈伤组织诱导培养基为MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋KT 1.0mg／L＋2，4-D 1.0mg／L，批pH＝5.8；生芽生根培养基可以选择MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA1.0mg／L NAA＋6-BA 1.0mg／L，pH＝5.8.

文山三七；组织培养；表面消毒；外源激素

三七（Panax notoginseng（BurK.）F.H.Chen）是我国传统珍贵的中药材，全国95%左右产自云南文山州，该部分三七又名文山三七.中医主要以三七块根入药.研究表明，三七主要成分为三七总皂甙、三七素、三七黄酮、三七多糖等，具有改善心脑血管疾病、降血糖、降血脂、降血压、抗血栓、抗衰老、抗休克、抗炎症、镇痛、镇静、增强免疫力等作用［1，2］.云南文山三七人工种植产业中，缺乏优质三七苗，病虫害严重，种植困难，产量低，三七原材料及其产品供不应求.

采用生物技术可以获得三七愈伤组织，进而可以进行三七组织培养、细胞培养、原生质体培养等研究，对三七种质资源的保护与利用，三七生理、生化、遗传、病理等研究有重要作用.目前国内外有关文山三七块根组织培养的报道很少.

本实验选取文山三七块根为外植体进行愈伤组织诱导和愈伤组织生芽、生根诱导研究，并研究外植体表面消毒方案和育苗条件，以期为文山三七组织培养研究提供一定理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 外植体来源

文山三七植株材料购买自云南省文山州三七种植户，通过快递送至西北民族大学榆中校区生命科学与工程学院.

1.1.2 试剂

MS培养基：Solarbio.蔗糖：天津市北辰方正试剂厂.琼脂：天津市光复精细化工研究所.NAA：上海山浦化工有限公司.6-BA：上海中泰化学试剂有限公司.KT：上海源叶生物科技有限公司.2，4-D：上海中泰化学试剂有限公司.无水乙醇：烟台市双双化工有限公司.次氯酸钠：烟台市双双化工有限公司.

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒方案选择

选择生长良好的外植体，流水冲洗干净，然后用75%乙醇消毒，灭菌水漂洗5次，再用2%次氯酸钠溶液消毒，灭菌水漂洗5次，乙醇、次氯酸钠溶液消毒时间见表1.

表1 外植体消毒试验

将消毒后的外植体接种到MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L，pH值为5.8的培养基（不添加任何外源激素的植物组织培养基础培养基），26℃暗培养，培养30d后，根据外植体诱导情况和污染率［8］［污染率（%）＝污染的外植体数／接种的总外植体数×100］选择最佳消毒方案.实验中观察统计时，只要接种外植体的锥形瓶中有一个单独外植体出现肉眼可观察到的真菌菌落或细菌菌落即将整瓶外植体认定为污染.

1.2.2 愈伤组织诱导培养基选择

外植体采用1.2.1最佳方案进行外植体消毒.在参照文献［3～7］的基础上，将外植体接种到MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋不同浓度的KT、2，4-D，pH值为5.8的培养基.激素浓度变化如表2所示.26℃ 暗培养观察诱导情况.实验中观察统计时，只要未污染的单个外植体出现肉眼可见的愈伤组织即认定该单个外植体被诱导出愈伤组织.

表2 激素浓度变化

1.2.3 分化培养基选择

通过无菌操作将愈伤组织团块取下，接种在MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋不同浓度的2，4-D、NAA、6-BA，pH值为5.8的培养基.激素浓度设置如表3，按L9（34）正交表设置激素浓度变化，如表4所示.26℃ 暗培养，观察统计分化情况.实验中观察统计时，只要未污染愈伤组织细胞团分化出现肉眼可见的单个胚状体，即认定该愈伤组织细胞团被诱导分化成功.

表3 激素浓度设置

表4 激素浓度变化

2 结果与分析

2.1 外植体消毒结果与分析

外植体消毒试验结果显示，随着消毒时间的增加未污染率升高，但是在未污染的外植体当中愈伤组织的诱导率却降低.这可能与消毒时间过长导致消毒液对外植体的损害程度加深有关.实验认为三七块根外植体最适消毒时间为75%乙醇消毒10s，再用2%次氯酸钠溶液消毒15min.实验结果如表5所示.

表5 外植体消毒结果

2.2 愈伤组织诱导实验结果与分析

本实验得到文山三七块根最佳愈伤组织诱导培养基为MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋KT 1.0 mg／L＋2，4-D 1.0mg／L，pH＝5.8.用该培养基诱导三七块根愈伤组织的诱导率为5%，如表6所示.将外植体上长出的愈伤组织切下培养，观察到愈伤组织细胞团紧密，颜色为浅土黄色，也有一些部分细胞团呈无色或半透明状，愈伤组织细胞团生长良好，如图1所示.

表6 诱导实验数据

2.3 生芽、生根实验结果与分析

本实验将得到的愈伤组织接种到分化培养基MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA 1.0mg／L＋6-BA 1.0mg／L，pH＝5.8（即表4中第2组实验培养基）进行暗培养.愈伤组织可以分化形成芽，分化成芽率为6%，并且用该培养基继续培养一周左右芽形成茎和叶，如图2所示.待茎生长到7cm左右，不用诱导生根，可自然长出根须如图3所示（实验观察统计时，只要生长出肉眼可见的根须即认定为生根；实验不观察统计根须的长度，数量等指标）.自此完整的三七苗形成.

图1 三七愈伤组织

图2 正在分化形成茎和叶的芽

图3 自然形成根和根的放大观察

3 结论与讨论

实验采用文山三七块根作为外植体用以进行植物组织培养研究，初步得到的最佳外植体表面灭菌方案为75%乙醇消毒10s，灭菌水漂洗5次，再用2%次氯酸钠溶液消毒15min，灭菌水漂洗5次.最佳愈伤组织诱导培养基为MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋KT 1.0mg／L＋2，4-D1.0mg／L，pH＝5.8.生芽生根培养基可以选择MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA 1.0mg／L＋6-BA 1.0mg／L，pH＝5.8.

在本实验中未污染的外植体愈伤组织诱导率较低，最大值仅为5%，分析原因有：①实验材料三七植株是以网购形式从云南省文山州三七种植户购买的，待三七植株由云南省文山州快递到甘肃省兰州市西北民族大学距离采集植株已经有3d左右的时间，且运输过程中苗未进行严格的低温保藏，在运输过程中植株有一定程度损伤，导致外植体活力降低.②三七块根细胞本身的脱分化、分裂能力低，在郑光植［3］、黄勇［7］等人的研究中都提到用三七块根诱导愈伤组织的成功率低（其文章中未见详细数据）.本实验结果与郑光植、黄勇等人研究结果有一定的相似性，所以可能是三七块根脱分化形成愈伤组织能力低造成的.

实验使用75%乙醇和2%次氯酸钠溶液消毒，然后将外植体接种到诱导培养基进行诱导，实验结果显示：外植体在MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L＋KT 1.0mg／L＋2，4-D 1.0mg／L，pH＝5.8的培养基上愈伤组织诱导率最佳.随着消毒时间的增加，消毒效果明显增加，但是，愈伤组织诱导效果却明显下降.笔者在综合考虑诱导率和污染控制的情况下认为三七块根外植体的最适消毒时间为75%乙醇消毒10s，再用2%次氯酸钠溶液消毒15min.

实验通过无菌操作将愈伤组织接种到分化培养基，来研究愈伤组织的分化和生根.实验中分化培养基含有的三种外源激素，即2，4-D、NAA、6-BA，是参考张智慧［4］、郑光植［5］、黄勇［7］的研究而制定的实验方案.针对实验中的3个实验研究因素，每个实验因素又有3个水平的情况，为节约资源和使实验设计具有科学性，实验采用正交法设计实验，利用L9（34）正交表设置激素浓度变化.分析本次实验结果：①用培养基MS＋蔗糖30g／L＋琼脂8g／L琼脂＋2，4-D 0.5mg／L＋NAA 1.0mg／L＋6-BA 1.0 mg／L，pH＝5.8.对愈伤组织进行暗培养，愈伤组织可以分化形成芽，再继续培养一周左右芽形成茎和叶，待茎生长到7cm左右，不用诱导生根，可自然生长出根须.②实验通过正交找到一个较好的培养基诱导愈伤组织分化，分化率为6%，且能实现生根.虽然未污染愈伤组织的分化率只有6%，且生根情况不佳，但是该培养基可以同时实现生芽与生根，能大幅度减少工作量，是比较理想的生芽生根培养基.由于本实验未采用全面实验法进行诱导，更未将实验因素的水平细化研究，所以可能有更适合三七块根愈伤组织诱导与分化生芽、生根的培养基配方.

［1］何晶.三七的药理作用及研究进展［J］.天津药学，2004，16（5）：58-59.

［2］杨志刚，陈阿琴，俞颂东.三七药理研究新进展［J］.上海中医药杂质，2005，39（4）：59-62.

［3］郑光植，王世林.三七愈伤组织的培养［J］.云南植物研究，1989，11（3）：255-262.

［4］张智慧，文国松，萧凤回，等.三七组织与细胞培养研究进展［J］.云南农业大学学报，2004，19（4）：369-372.

［5］郑光植，王世林，甘烦远.三七组织培养的建立［J］.生物工程学报，1989，5（1）：64-69.

［6］黄天卫，杨莉，韦美丽，等.不同激素配比对诱导三七花蕾愈伤组织影响［J］.文山学院学报，2014，27（3）：5-7.

［7］黄勇，张铁，张文生等.三七组织培养研究综述［J］.文山学院学报，2012，25（6）：13-15.

S567.236

A

1009-2102（2016）04-0062-05

2016-08-02

2015年西北民族大学中央高校基本科研业务费本科生科研项目.

＊

李涛（1992—），男（彝族），云南文山人.