山奈素对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制

梁滨，肖永生，李荣霖

(天津市宁河区医院，天津301500)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其临床治疗方法主要以外科手术为主，并辅助放疗、化疗等[1]。放、化疗药物在某种程度上能够抑制乳腺癌的发展，但其不良反应较大，在杀死肿瘤细胞的同时对机体正常细胞也会造成损伤，并且易产生耐药性[2,3]。因此，从天然产物中寻找高效且不良反应小的抗乳腺癌药物是近年来研究的热点。山奈素是一种在高等植物中广泛存在的黄酮类化合物，具有降血压、降血脂、祛痰等多种功效。目前，山奈素对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制均鲜见报道。为此，我们于2018年6月～2019年4月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌MCF7细胞购于中国科学院上海细胞库。山奈素购于上海纯优生物科技有限公司，有丝分裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/MEK/ERK)信号通路抑制剂索拉菲尼(sorafenib)购于美国Glpbio公司，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活剂ML-099购于上海伟寰生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于北京雷根生物技术有限公司，RIPA裂解液和BCA蛋白测定试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所，磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(p-Raf-1)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和β-肌动蛋白(β-actin)抗体均购于美国Abcam公司。

1.2 细胞培养 从液氮罐中取出MCF7细胞冻存管，37 ℃水浴快速融合，转移至15 mL离心管中。加入适量PBS混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入适量PRMI1640培养基，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入适量含10% FBS的PRMI1640培养基，混悬后转移至培养瓶中，常规培养箱中培养。待细胞融合至80%～90%时，胰酶消化，传代培养用于后续实验。

1.3 山奈素浓度筛选 采用MTT法。取对数生长期的MCF7细胞，调整细胞密度为2.5×104/mL，每孔200 μL接种于96孔板中，37 ℃、5% CO2、97%湿度培养箱中培养。细胞贴壁后分为两部分，一部分分别加入含终浓度为25、50、75、100 μg/mL山奈素[4]的培养基，另一部分加入等量PRMI1640培养基。两部分细胞分别于培养12、24、48、72 h，每孔加入浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，培养箱中继续孵育4 h。吸弃培养基，每孔加入二甲基亚砜溶液150 μL，孵育5 min，混合均匀。于全自动酶标仪检测490 nm波长处的光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。结果显示，加入75 μg/mL山奈素作用48 h后细胞增殖抑制率为54.39%±1.73%，达到半数有效剂量。因此，选择75 μg/mL山奈素作用48 h作为后续研究的实验条件。

1.4 细胞分组处理 取对数生长期的MCF7细胞，细胞贴壁后分为山奈素组、sorafenib组、ML-099+山奈素组、空白对照组，分别加入含75 μg/mL山奈素的培养基、含10 μmol/L sorafenib[5]的培养基、含5 μmol/L ML-099[6]与75 μg/mL山奈素的培养基、等量PRMI1640培养基。

1.5 细胞增殖抑制率检测 各组培养48 h，参照1.3采用MTT法检测细胞增殖抑制率。

1.6 细胞凋亡能力检测 采用流式细胞术。各组培养48 h，吸弃上清液，预冷的PBS清洗细胞，胰酶消化后收集细胞。调整细胞密度为1×106/mL,取0.5 mL细胞悬液于1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入195 μL的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC结合液，轻轻吹打均匀，室温条件下避光反应15 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入190 μL的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入10 μL PI，轻轻吹打均匀，冰浴避光反应15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 细胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。各组培养48 h，胰酶消化并收集细胞。PBS清洗，加入TRIzol试剂提取总RNA。紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度合格后，使用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增。Raf-1上游引物5′-GGAGCTTGGAAGACGATCAG-3′，下游引物5′-CTCCGTGCCATTTACCCTTA-3′，引物长度1 096 bp；ERK上游引物5′-TCATAGGCATCCGAGACATC-3′，下游引物5′-TGGTAGAGGAAGTAGCAGA TG-3′，引物长度186 bp；Cyclin D1上游引物5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3′，下游引物5′-CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3′，引物长度246 bp；Caspase-3上游引物5′-AAAGTGCCTGGACGCGCGTT-3′，下游引物5′-AGTGGGCCGCCTGGAGAGG-3′，引物长度238 bp；内参β-actin上游引物5′-CTGGGACGACATGGACAAAA-3′，下游引物5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，引物长度180 bp。PCR扩增条件：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共45个循环。采用 2-ΔΔCt法计算Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA相对表达量。

1.8 p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白表达检测 采用Western blotting法。各组培养48 h，胰酶消化并收集细胞。PBS清洗后，加入不含蛋白酶的RIPA裂解液，置于冰上裂解，时间30 min。4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，收集上清液即为蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白，加入上样缓冲液，煮沸5 min，蛋白变性后行SDS-PAGE电泳。将蛋白转移至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h。分别加入p-Raf-1(1∶600)、p-ERK(1∶800)、Cyclin D1(1∶400)和Caspase-3(1∶200)一抗，4 ℃孵育12 h。次日洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的IgG(1∶200)，室温孵育1 h。再次洗膜，加入ECL化学发光试剂，避光显影，Bio-Rad凝胶成像系统曝光拍照。采用Image Pro Plus6.0软件分析蛋白条带的灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率比较 见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率比较

注：与山奈素组比较，*P<0.05；与sorafenib组比较，#P<0.05；与ML-099+山奈素组比较，△P<0.05。

2.2 各组细胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA表达比较 见表2。

表2 各组细胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA相对比表达量比较

注：与山奈素组比较，*P<0.05；与sorafenib组比较，#P<0.05；与ML-099+山奈素组比较，△P<0.05。

2.3 各组细胞p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白表达比较 见表3。

表3 各组细胞p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白相对比表达量比较

注：与山奈素组比较，*P<0.05；与sorafenib组比较，#P<0.05；与ML-099+山奈素组比较，△P<0.05。

3 讨论

乳腺癌具有较高的发病率和病死率，已成为严重威胁女性健康的“头号杀手”。近年来乳腺癌患者的治疗效果有了较大改善，但放、化疗药物具有较大的不良反应和肿瘤耐药性，因此寻找新的高效、低毒药物成为研究者们关注的热点[7]。研究显示，从天然植物中提取的黄酮类化合物具有较好的抗肿瘤作用，如槲皮素可通过抑制STAT通路抑制胶质瘤干细胞增殖并促进其凋亡[8,9]。木犀草素可能通过激活p53信号通路、上调miR-34a-5p表达，发挥抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡的作用[10]。芹菜素可抑制乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞的增殖，诱导其凋亡，具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用[11]。山奈素作为一种黄酮类化合物，也表现出了一定的抗肿瘤作用，但目前其对乳腺癌细胞的作用机制鲜见报道。本研究结果显示，山奈素可抑制乳腺癌MCF7细胞增殖并促进其凋亡，具有浓度和时间相关性，提示山奈素可能是乳腺癌治疗的潜在药物。其中加入75 μg/mL山奈素作用48 h后细胞增殖抑制率为54.39%±1.73%，达到半数有效剂量，因此选择75 μg/mL山奈素作用48 h作为后续研究的实验条件。

Raf-1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与促进有丝分裂信号从细胞膜到细胞核的转导，在细胞增殖相关信号转导途径中发挥重要作用，与肿瘤发生、细胞周期调控及细胞凋亡等密切相关[12]。ERK属于酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有ERK1和ERK2两种亚型。MEK属于MAP2K家族成员，其作用是磷酸化并激活下游底物ERK1/2[13]。Cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白，其表达升高可促使细胞由G1期向S转换，促进细胞增殖[14]。Caspase级联反应参与细胞的凋亡过程，Caspase-3是细胞凋亡的“执行者”，其表达升高可促进细胞凋亡[15]。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路在调节细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用[16,17]。Ras募集并激活Raf，激活后的Raf可促进MEK1/2和ERK1/2激活，激活后的ERK1/2可调节多个转录因子，引起不同基因表达。Raf/MEK/ERK通路激活后，p-Raf-1、p-MEK、p-ERK蛋白表达增加，促进Cyclin D1与CDK4/6结合形成复合体并激活CDK，加速细胞从G1期向S期转化，从而促进细胞增殖，引起肿瘤发生[18]。本研究结果显示，sorafenib 组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均高于空白对照组，说明Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与了乳腺癌的发生和发展；山奈素组细胞Raf-1、ERK、Cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达量均低于ML-099+山奈素组、空白对照组，Caspase-3 mRNA及蛋白相对表达量均高于ML-099+山奈素组、空白对照组，说明山奈素可下调乳腺癌细胞Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关基因和蛋白表达，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活剂的加入可降低山奈素对该信号通路的影响。因此，抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路可能是山奈素抑制乳腺癌细胞增殖并促进其凋亡的机制之一。

综上所述，山奈素能在一定程度上抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡，其可能通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活而发挥作用，是乳腺癌治疗的潜在药物。但是，山奈素是否通过其他通路发挥抗乳腺癌作用仍有待深入研究。