姜黄素对人表皮角质形成细胞HaCaT增殖、凋亡的影响及其机制

汪五清，曾义斌，张彤，张超，贺燕妮，杜凌波，强燕

(1上海市闵行区中心医院，上海201199；2上海交通大学医学院附属松江医院)

银屑病是一种自身免疫性慢性炎症性疾病，发病机制尚未完全明确，其致死率较低，但是会严重降低患者的生活质量[1,2]。银屑病是以角细胞过度增殖为主要病理变化，因此既往多以人表皮角质形成细胞HaCaT为细胞模型进行基础研究[3]。姜黄素是一种从姜黄等药用植物中提取的植物多酚，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等多种作用[4]，临床上广泛应用于肿瘤、骨关节炎、脊髓损伤、心血管疾病、糖尿病等疾病的治疗，且取得了较好疗效[5]。目前关于姜黄素治疗银屑病的研究较少，其作用机制也未阐明。2016年6月～2018年12月，本研究观察了姜黄素对HaCaT细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：HaCaT细胞购自美国ATCC细胞库。主要试剂：姜黄素购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibico公司;MTS增殖检测试剂盒购自美国Biovision公司，细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物技术有限公司，细胞周期检测试剂盒和RIPA裂解液购自碧云天生物科技有限公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo公司，PVDF膜购自索莱宝科技有限公司;血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体orb163157购自英国Biorbyt 公司，细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗体ab16663、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗体ab32124、GAPDH抗体ab181602均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养及分组处理 将HaCaT细胞培养在含10% FBS的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2全湿培养箱中。待细胞融合至90%时，按1∶3进行传代。取对数生长期的HaCaT细胞，随机分为高、中、低浓度姜黄素组和对照组，高、中、低浓度姜黄素组分别加入终浓度为40、20、10 μmol/L的姜黄素，对照组加入等量培养基。

1.3 细胞增殖能力观察 采用MTS法。取对数生长期的HaCaT细胞，以2×103/孔接种于96孔培养板中，参照1.2的方法进行分组处理，每组设置6个复孔，并设置空白对照。各组作用48 h，每孔加入30 μL MTS试剂，37 ℃细胞培养箱中孵育2 h。全波长扫描仪获得490 nm波长处的OD值，细胞增殖抑制率=1-(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.4 细胞克隆形成能力观察 采用平板克隆实验。取对数生长期的HaCaT细胞，以3×102/孔接种于6孔培养板中，参照1.2的方法进行分组处理，每组设置3个复孔。各组作用2周待克隆团长出后，终止培养。甲醇固定细胞，结晶紫染色，记录克隆形成数。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取对数生长期的HaCaT细胞，以6×105/孔接种于6孔培养板中，参照1.2的方法进行分组处理，每组设置3个复孔。各组作用48 h，加入无EDTA的胰酶消化收集细胞，PBS冲洗3次，重悬于500 μL Binding Buffer中。分别加入5 μL FITC和PI染液，37 ℃条件下避光孵育30 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞周期比例检测 采用流式细胞术。取对数生长期的HaCaT细胞，以6×105/孔接种于6孔培养板中，参照1.2的方法进行分组处理，每组设置3个复孔。各组作用48 h，加入胰酶消化收集细胞，PBS冲洗3次后，重悬于500 μL染色缓冲液中。分别加入250 μL PI和10 μL RNaseA染液，37 ℃条件下避光孵育30 min。上流式细胞仪检测细胞周期比例。实验重复3次，取平均值。

1.7 VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期的HaCaT细胞，以5×106/孔接种于10 cm3培养皿中，参照1.2的方法进行分组处理，每组设置3个复孔。各组作用48 h，胰酶消化收集细胞，PBS冲洗3次，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA。超声裂解30 min，4 ℃条件下14 000 r/min离心20 min。BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸变性后冷却，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白。350 mA湿转转膜120 min，TBST冲洗后5% BSA室温封闭2 h。分别加入VEGF、Cyclin D1、Bcl-2及内参蛋白GAPDH一抗(稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST冲洗3次;加入二抗(稀释比例均为1∶10 000)，室温孵育2 h。ECL化学发光法曝光条带，采用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值计算VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率、克隆形成数、细胞凋亡率比较 高、中、低浓度姜黄素组和对照组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均依次降低，克隆形成数依次升高，两组间比较P均<0.05。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率、克隆形成数、细胞凋亡率比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度姜黄素组比较，#P<0.05；与中浓度姜黄素组比较，△P<0.05。

2.2 各组细胞周期比例比较 高浓度姜黄素组G0/G1期细胞比例均高于中、低浓度姜黄素组和对照组，G2/M期细胞比例均低于中、低浓度姜黄素组和对照组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞周期比例比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度姜黄素组比较，#P<0.05；与中浓度姜黄素组比较，△P<0.05。

2.3 各组细胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达比较 高、中、低浓度姜黄素组和对照组细胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达量均依次升高，两组间比较P均<0.05。见表3。

表3 各组细胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度姜黄素组比较，#P<0.05；与中浓度姜黄素组比较，△P<0.05。

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，以红色斑块上覆盖银白色鳞片为主要特征，最常发病于皮肤、指甲和关节等部位[2]。银屑病病情顽固，复发率高，临床上缺乏有效的治疗手段[6]。银屑病男女发病率无明显区别，但是具有遗传性，35%～90%的银屑病患者有家族史[1]。目前银屑病的发病原因不明，炎症细胞弥漫浸润、角质形成细胞过度增殖以及新生血管形成是银屑病的特征性病理表现，在临床上主要通过恢复角化细胞、止痒、调节免疫和靶向药物等方法治疗银屑病，但是效果并不理想[2]。

姜黄素属于植物多酚，是一种稀有的二酮色素，主要从姜科植物的根茎中提取，为橙黄色粉末，多用于酱卤制品、罐头等食品的着色。近年来发现姜黄素除了传统用途，还具有药用价值，主要的药理作用包括减轻炎症反应、抗氧化反应、抗肿瘤、抗纤维化、调节免疫、降糖和降脂等[4]。姜黄素属于天然产物，安全性较高，不良反应小，在临床上可用于治疗多种疾病[5,6]。研究表明，姜黄素可抑制结直肠癌细胞的增殖分化，并促进细胞凋亡[7,8]。银屑病是T细胞介导的自身免疫性炎症性疾病[9]，目前，关于姜黄素是否可以抑制银屑病的进展鲜见报道。本研究结果显示，姜黄素可抑制HaCaT细胞增殖、促进其凋亡，并呈浓度相关性。细胞周期与细胞增殖密切相关，Cyclin D1是细胞周期的正调控因子，可促使细胞由G0/G1期进入S期，从而进行有丝分裂、促进细胞增殖[10]。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，在正常状态下Bcl-2不表达或者表达较低，在增殖细胞内Bcl-2过度表达而拮抗细胞凋亡，使细胞维持在长期存活的状态[11,12]。本研究结果显示，姜黄素可将HaCaT细胞阻滞于G0/G1期，并抑制HaCaT细胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达，且呈浓度相关性；这说明姜黄素抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的机制可能与抑制Cyclin D1、Bcl-2表达，从而使细胞阻滞于G0/G1期有关。

银屑病是一种复杂的多因素疾病，表现为表皮细胞生长、分化以及多种免疫因子异常和血管新生，其中异常新生的微血管与银屑病的发生、发展密切相关，在银屑病红斑真皮乳头层中可见迂曲、扩张的新生微血管[13]。血管异常新生受血管生长因子和抑制因子调控，在正常状态下两者维持平衡，当外部刺激时血管生长因子生成增多，可导致血管病理性生成[14]。VEGF是一种重要的促血管生长因子，在银屑病早期VEGF可促进血管基底膜分解及内皮细胞迁移，银屑病后期可促进内皮细胞增殖，调节与重构血管新生网络，在银屑病的发生、发展中具有重要作用[15]。研究表明，VEGF可参与肿瘤血管新生，在肿瘤的侵袭、转移等恶性生物学行为中具有重要作用[16,17]。本研究结果显示，姜黄素处理HaCaT细胞后VEGF蛋白表达降低，并呈浓度相关性；表明姜黄素可能通过抑制VEGF而调控HaCaT细胞的增殖与凋亡，最终参与血管新生。

综上所述，姜黄素可抑制HaCaT细胞增殖、促进细胞凋亡，并呈浓度相关性，其机制可能与抑制VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达有关。