卡维地洛预处理对缺氧/复氧诱导心肌H9C2细胞凋亡的影响及其机制

赵勇，徐岩，姬婷婷

(安徽医科大学附属阜阳医院，安徽阜阳236000)

急性心肌缺血可直接导致心肌细胞死亡，再灌注后也会引起心肌细胞凋亡[1]。急性心肌缺血动物实验表明，细胞凋亡主要发生在缺血坏死区域周围，可促进梗死面积的扩大[2]。因此，减轻缺血再灌注损伤所致心肌细胞凋亡对于减小梗死面积具有重要意义。在心肌组织中Toll样受体(TLRs)主要表达TLR2和TLR4，而TLR4/NF-κB信号通路是参与细胞凋亡的重要信号通路之一[3,4]。β-arrestin2为NF-κB的调控蛋白，参与TLR4/NF-κB信号通路调控。卡维地洛为第三代β受体阻滞剂，在非选择性阻断β受体的同时，还选择性阻断α1受体，并具有钙拮抗作用，能显著改善心肌梗死、心衰患者的预后，但是其作用机制相关报道较少[5]。2015年11月～2017年11月，本研究观察了不同浓度卡维地洛预处理对缺氧/复氧后心肌细胞凋亡的影响，并探讨其机制是否与β-arrestin2及TLR4/NF-κB信号通路有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：心肌H9C2细胞(简称H9C2细胞)由安徽医科大学基础医学院提供。主要药品及试剂：卡维地洛购于山东齐鲁制药有限公司，胎牛血清购于美国Hyclone公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、RIPA细胞裂解液购于碧云天生物技术有限公司，电化学发光(ECL)试剂盒购于美国Pierce公司，TLR4封闭抗体购于德国CST公司，荧光测定TUNEL凋亡检测系统购于美国Promega公司。主要仪器：EPS300型电泳仪购于上海天能科技有限公司，荧光定量PCR仪ABI7500购于美国ABI公司，Modulus多功能光度计购于美国BioSystems公司，倒置荧光显微镜购于日本Olympus公司。

1.2 细胞分组处理 将对数生长期的H9C2细胞分为模型组、低剂量卡维地洛组、中剂量卡维地洛组、高剂量卡维地洛组、TLR4封闭抗体组和对照组。对照组在37 ℃、5% CO2的无菌培养箱中培养12 h，常规换液，其余各组参照Esumi等[6]的方法建立细胞缺氧/复氧模型。低、中、高剂量卡维地洛组及TLR4封闭抗体组分别在缺氧/复氧损伤前30 min加入1、5、10 μmol/L卡维地洛及20 μg/mL TLR4封闭抗体进行预处理。

1.3 细胞凋亡率检测 采用TUNEL法。取各组细胞，加入配置好的TUNEL检测液，制成载玻片。在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在(520±20)nm波长下观察荧光素-12-dUTP掺入并定位的绿色荧光，>620 nm波长下观察碘化丙啶定位的红色荧光。红色荧光表示存活细胞与凋亡细胞的细胞核，绿色荧光表示凋亡细胞的细胞核。计数视野内的凋亡细胞与总细胞，计算细胞凋亡率。

1.4 凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达检测 采用Western blotting法。取各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；配制SDS-PAGE凝胶，以每孔25 μg等质量上样，浓缩胶所用电压为80 V，时间为30 min；分离胶所用电压为120 V，时间为1 h；待溴酚蓝刚跑出时终止电泳。采用半干转膜法将蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h；加入一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10 000)孵育，TBST洗膜3次，ECL显色。以β-actin作为内参，采用Image J软件进行灰度值分析，计算目的条带与内参条带灰度值的比值。

1.5 TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA，微量核酸定量仪定量检测各样本RNA浓度及纯度合格后，参照反转录试剂盒说明书逆转录RNA合成cDNA。TLR4上游引物5′-TCATGCTTTCTCACGGCCTC-3′，下游引物5′-AGGAAGTACCTCTATGCAGGGAT-3′，引物长度142 bp；NF-кB上游引物5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′，下游引物5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′，引物长度150 bp；β-arrestin2上游引物5′-CACAAAAGGAACTCCGTGCG-3′，下游引物5′-AGACATGAGGAAGTGGCGTG-3′，引物长度105 bp；内参β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游引物5′-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′，引物长度70 bp。PCR反应体系20 μL： 2×Goldstar Taqman mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，Probe 0.4 μL，模板DNA 2 μL，Rnase Free water 6.8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表达比较 与对照组比较，其余各组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均升高，Bcl-2蛋白表达降低，以模型组变化最明显(P均<0.05)。低、中、高剂量卡维地洛组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均依次降低，Bcl-2蛋白表达均依次升高(P均<0.05)。见表1、图1。

表1 各组细胞凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表达比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量卡维地洛组比较，cP<0.05；与中剂量卡维地洛组比较，dP<0.05。

注：A为对照组，B为模型组，C为低剂量卡维地洛组，D为中剂量卡维地洛组，E为高剂量卡维地洛组，F为TLR4封闭抗体组。

图1各组Bax、Bcl-2蛋白表达情况(Western blotting法)

2.2 各组TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA表达比较 与对照组比较，模型组TLR4、NF-κB mRNA表达均升高，β-arrestin2 mRNA表达均降低，TLR4封闭抗体组NF-κB mRNA表达降低(P均<0.05)。与模型组比较，TLR4封闭抗体组及低、中、高剂量卡维地洛组TLR4、NF-κB mRNA表达均降低，TLR4封闭抗体组及高剂量卡维地洛组β-arrestin2 mRNA表达均升高(P均<0.05)。与低剂量卡维地洛组比较，中、高剂量卡维地洛组TLR4、NF-κB mRNA表达均降低，β-arrestin2 mRNA表达均升高(P均<0.05)。见表2。

表2 各组TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA表达比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量卡维地洛组比较，cP<0.05；与中剂量卡维地洛组比较，dP<0.05。

3 讨论

心肌再灌注是治疗急性心肌梗死的重要措施，但随着心肌细胞缺血情况的改善，再灌注损伤成为患者预后不良的重要原因[7,8]。Gottlieb等[9]在家兔离体心脏再灌注模型中发现，家兔心脏缺血30 min、4.5 h时均无细胞凋亡发生，而缺血30 min再灌注4 h后出现明显的心肌细胞凋亡。卡维地洛是一种新型非选择性肾上腺素能受体阻滞剂，可以阻断β1、β2和α1受体，且不增加心肌对儿茶酚胺的敏感性，具有良好的无内在拟交感活性、极强的抗氧化损伤作用等。卡维地洛对细胞信号传导的影响可以通过多种通路进行，如下调miRNA表达、抑制AKT/XIAP信号通路等[10,11]。但是，卡维地洛减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的分子机制尚不清楚。

Bcl-2家族蛋白是第一个被发现与凋亡有关的蛋白，该家族蛋白具有很多同源基因或蛋白，其中研究比较广泛的是具有抑制细胞凋亡作用的Bcl-2、McLI、Al、Befl以及具有促进细胞凋亡作用的Bax、Bad、Bik等。研究表明，Bcl-2可通过直接抗氧化作用[12]、抑制Caspase激活[13]、维持细胞内钙平衡、抑制核酸内切酶等途径抑制细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，其余各组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均升高，Bcl-2蛋白表达均降低，以模型组变化最明显，而低、中、高剂量卡维地洛组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均依次降低，Bcl-2蛋白表达均依次升高；这说明卡维地洛可减轻H9C2细胞缺氧/复氧造成的细胞凋亡，并具有浓度相关性。

TLR4是人类发现的首个TLRs相关蛋白，几乎在所有细胞中均有表达，并参与动脉粥样硬化、血栓、心肌重构、缺血再灌注损伤甚至瓣膜性疾病等心血管疾病的病理过程。TLR4被激活后启动信号通路，转运到细胞内并活化NF-κB；而NF-κB是调控多种基因转录的重要因子，在细胞凋亡调控、免疫应答、炎症反应中发挥重要作用[14]。β-arrestin2是NF-κB的负调控因子，可招募CARMA3到溶血磷脂酸(LPA)受体，在GPCR介导的NF-κB信号通路中发挥重要作用[15]。本研究结果显示，TLR4封闭抗体组细胞凋亡率、Bax蛋白表达均低于模型组，Bcl-2蛋白表达高于模型组，说明凋亡相关蛋白Bcl2、Bax表达受TLR4信号通路调控，TLR4信号通路参与了心肌细胞缺氧/复氧过程中的细胞凋亡；模型组TLR4和NF-κB mRNA表达明显高于对照组，而TLR4封闭抗体组TLR4和NF-κB mRNA表达均低于模型组，β-arrestin2 mRNA表达高于模型组;结合细胞凋亡结果，证实β-arrestin2对TLR4具有负调节作用,且TLR4/NF-κB信号通路与缺氧/复氧损伤导致的心肌细胞凋亡有关。本研究中，低、中、高剂量卡维地洛组TLR4、NF-κB mRNA表达均低于模型组，以中、高剂量卡维地洛组变化更明显，说明中等剂量的卡维地洛即可抑制TLR4/NF-κB信号通路；但是，低、中、高剂量卡维地洛组β-arrestin2 mRNA表达逐渐升高，与TLR4、NF-κB mRNA表达变化并不同步，说明卡维地洛既可以直接抑制TLR4/NF-κB信号通路，又可通过增加β-arrestin2表达而负调控TLR4/NF-κB信号通路。

综上所述，卡维地洛预处理能够减轻缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡，并呈浓度相关性，其机制可能与升高β-arrestin2表达及抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。