原发性肝细胞癌组织中LAP+CD4+ T细胞比例变化及其与患者临床病理特征的关系

蒋春艳，陈木兴，谢丽平，林涛发，王少扬

(1蚌埠医学院福总教学医院，福州350000；2中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院)

原发性肝细胞癌(HCC)被列为全世界癌症相关死亡的第二大原因，我国HCC发病及死亡人数在全世界范围内占比均为50%左右[1]。当肝细胞发生癌变时，癌周结构和细胞群体均发生改变，这种恶性细胞与周围非恶性基质之间的结构成分和动态相互作用被称为肿瘤微环境[2]。免疫细胞分布和功能异常是HCC发生和发展的重要机制，也是HCC微环境改变的主要特征。调节性T细胞(Tregs)是肿瘤微环境中的重要免疫调节成分，具有独特的免疫抑制能力，可以削弱机体的抗肿瘤能力，协助肿瘤细胞完成免疫逃逸[3]。LAP+CD4+T细胞是新发现的一种Tregs亚群[4]，具有比经典CD4+CD25+Foxp3+T细胞更强的肿瘤抑制活性[5]。有研究表明，LAP+CD4+T细胞具有比LAP-CD4+T细胞更高的肿瘤组织归巢倾向，提示LAP+CD4+T细胞可能参与了肿瘤的发生与发展[6]。但是关于LAP+CD4+T细胞比例在HCC肿瘤微环境中的变化及临床意义鲜有报道。为此，本研究观察了HCC患者癌组织中LAP+CD4+T细胞比例变化，并分析其与患者临床病理参数的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年12月～2018年10月于中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院进行初次手术治疗的HCC患者30例，男22例、女8例，年龄27～71岁，血清甲胎蛋白(AFP)<200 ng/mL 16例，≥200 ng/mL 14例；AST/ALT<1.0 17例，≥1.0 13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例。患者均经术后病理确诊为HCC，排除接受过靶向药物治疗、射频消融、经导管动脉化疗栓塞及免疫治疗等抗肿瘤治疗的患者，合并自身免疫性疾病的患者。本研究通过中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

1.2 组织LAP+CD4+T细胞比例检测 选取患者术中切除的新鲜癌组织及距肿瘤2 cm处相应的癌旁组织(大小约为2 cm×1 cm×1 cm)，去除坏死组织、脂肪及其他正常组织。眼科剪剪碎，置入配制好的组织消化液中，37 ℃条件下恒温震荡消化1 h。70 μm一次性细胞滤网滤过，将滤液吸至15 mL离心管中，25 ℃条件下1 500 r/min离心10 min，吸去上层清液，沉淀中加入PBS 4 mL重悬，制备细胞悬液。各取100%和75% ficoll-hypaque淋巴分离液(北京索莱宝生物有限公司)2 mL，依次缓慢加至另一个15 mL离心管中，于最上层加入细胞悬液4 mL，25 ℃条件下2 000 r/min离心35 min，一次性无菌吸管收集100%和75% ficoll-hypaque淋巴分离液之间的云雾状细胞层。加入PBS 3 mL，1 500 r/min离心10 min，25 ℃条件下洗涤2次。加入1%BSA重悬，调整细胞密度为2×106/mL。每份标本各取出100 μL分装于2个EP管中，标记为实验管与同型对照管。暗室条件下各取5 μL抗CD4、抗LAP抗体(美国eBioscience公司)加入实验管，同型对照管加入相应同型抗体，暗室中室温孵育40 min。加入PBS 500 μL，25 ℃条件下2 000 r/min离心6 min，弃上清后重悬。上流式细胞仪(美国BD公司)检测LAP+CD4+T细胞比例占总CD4+T细胞的百分比，即为LAP+CD4+T细胞比例。分析癌组织LAP+CD4+T细胞比例与患者临床病理参数的关系。

2 结果

2.1 HCC患者癌组织及癌旁组织中LAP+CD4+T细胞比例比较 HCC患者癌组织及癌旁组织中LAP+CD4+T细胞比例分别为11.57%±1.59%、5.74%±0.89%，两者比较P<0.01。

2.2 HCC患者癌组织LAP+CD4+T细胞比例与临床病理参数的关系 HCC患者癌组织LAP+CD4+T细胞比例与性别、年龄、血清AFP水平及AST/ALT均无关(P均>0.05)，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的HCC患者癌组织LAP+CD4+T细胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者(P<0.05)。见表1。

表1 HCC患者癌组织LAP+CD4+ T细胞比例与临床病理参数的关系

3 讨论

免疫逃逸是正常细胞转化为恶性细胞，以及恶性细胞随后存活所必需的关键机制。免疫系统可以通过一种叫做免疫编辑的复杂机制来促进癌细胞的形成[7]。在清除阶段，转化后的细胞可以被免疫细胞(如细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤细胞)破坏;但在平衡阶段，肿瘤细胞可降低其免疫原性，以逃避免疫杀伤机制，最终在逃逸期形成肿瘤。肝脏通过门静脉不断暴露在各种高水平的抗原中，肝脏微环境表现为强大的免疫抑制作用，以防止自身免疫性肝损伤的发生[9]。在肝脏免疫微环境中，Tregs和髓源性抑制细胞等免疫调节细胞发挥抑制免疫反应作用，从而促进肝脏肿瘤的发生[8]。鉴于肝脏特殊的免疫环境，临床上需要充分研究肝脏肿瘤微环境中免疫成分的改变，从而进一步明确免疫成分在产生抗肿瘤免疫应答过程中所发挥的作用。

研究表明，HCC患者癌组织浸润淋巴细胞中Tregs数量增加[10]。一项关于肝癌的研究显示，通过抑制Tregs功能可以增强抗肿瘤免疫应答效应[11]。Tregs在HCC患者血液中的比例明显升高，而Tregs比例与HCC严重程度有关[12,13]。此外，与癌旁组织相比，癌组织Tregs大量聚集后伴随CD8+T细胞数量减少[14]。因此，肿瘤浸润性Tregs数量增加可能促进了HCC的进展，并有可能与患者预后不良有关。LAP是一种前肽，与TGF-β的氨基末端非共价结合并产生潜伏的TGF-β复合物，从而促进TGF-β1向细胞外基质释放。此外，潜伏的TGF-β复合物可表达于血小板、树突状细胞和Tregs等多种免疫细胞的细胞膜，并参与免疫调节机制[6]。LAP+CD4+T细胞是人外周血中非Foxp3+阳性抑制细胞的一个新子集，在体外可以抑制其他T细胞增殖，其抑制作用可能由TGF-β和IL-10介导[3]。本研究结果显示，HCC患者癌组织LAP+CD4+T细胞比例升高，癌组织LAP+CD4+T细胞比例与患者的性别、年龄、血清AFP水平及AST/ALT均无关，但TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者癌组织LAP+CD4+T细胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者，说明LAP+CD4+T细胞可能通过其自身免疫抑制性而促进HCC进展。本研究结果显示，癌组织LAP+CD4+T细胞比例明显高于癌旁组织，提示LAP+CD4+T细胞具有一定向肿瘤组织归巢的趋向性;但是,随着HCC疾病进展，这些细胞是否会在肿瘤微环境中积累并向外周血释放仍需进一步观察。

综上所述，HCC患者癌组织LAP+CD4+T细胞比例升高，且LAP+CD4+T细胞可能参与了HCC的疾病进展。