三种山苍子精油化学成分及抑菌效果差异分析

王 雪，梁晓洁，高 暝，吴立文，汪阳东，陈益存

中国林业科学研究院亚热带林业研究所，杭州 311400

山苍子是樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea)多种植物的统称，中国近50种，其中作为“芳香油料树”被管理及广泛栽培的主要有3种，即毛叶木姜子(Litseamollis)(俗称大木姜)、山鸡椒Litseacubeba(Lour.) Pers.(俗称小木姜)及其变种毛山鸡椒(Litseacubebavar.formosana)[1]。山苍子主要分布在亚洲东部，中国、马来西亚等，大洋洲和太平洋诸岛[2]，中国主要分布在长江以南的各省份，居于海拔500～3 200米的疏林或林中路旁，通常是森林植被破坏后的先锋树种。作为我国重要的经济香料树种之一，山苍子果实可入药(荜澄茄)，用于治疗肠胃不适和呼吸道等疾病，亦可作为食品中的添加剂以及化妆品的抗氧化和增香剂。山苍子精油主要从果实中提取，淡黄色、不溶于水、高度挥发，具强烈的芳香气味，已被国家食品药品监督管理局批准用于食品中(GB 2760-86)，并被广泛用作化妆品的香料增香剂[3]。

近年来，随着人们环保意识的增强，天然抑菌产品需求增大，也激起了国内外科学家对植物精油抗菌特性的兴趣[4]。早在1999年，植物精油就被认为是合成食品添加剂和作物保护物质的安全替代品[5]。此外，部分植物精油具有抗虫、抑制植物病原体的作用[6]。

迄今为止，大量文献报道了山苍子精油的抗菌特性。在食品防腐方面，山苍子精油对副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)具有显著的抑菌活性[4]。在药用和农产品保护方面，山苍子精油对黄曲霉(Aspergillusavus)有很强的抗菌活性，能够抑制菌丝生长和改变其超微结构，被认为是一种安全的天然植物保护剂。基于实验室小鼠和大鼠的遗传毒性试验，山苍子精油对人类的安全性得到证实[4]。大量研究表明，山苍子精油具有广谱抑菌性[7]，是一种不可缺少的天然抗菌材料，具有巨大的应用潜力和推广价值。但大部分研究未对山苍子进行具体物种鉴定，所研究和推广的山苍子精油是山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒果实精油的混合产物，亟待对这三种山苍子精油品质进行评价。

为鉴定三种山苍子抑菌效果差异，我们选择了十大植物病原真菌代表种尖孢镰刀菌[8]，以及食源性疾病的常见致病菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和李斯特菌[9]。作为抑菌实验对象，分别检测山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒三个物种的精油抑菌活性，同时精油化学成分检测和抑菌活性相关性分析，最终对三种山苍子精油进行评价，为山苍子遗传育种和开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 植物材料

三种山苍子分别从贵州、福建、安徽、重庆、江西和浙江收集到的优良单株，经丁炳杨教授鉴定分别为山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒。收集的优良单株的种子种植在贵州黎平的实验基地。于2017年8～9月从试验基地采集每种山苍子树龄3年的5个家系的果实作为生物学重复，通过水蒸馏法获得山苍子精油，三种山苍子信息以及果实精油含量如表1所示。

表1 三种山苍子各样本果实精油信息统计表Table 1 The information statistics list of fruit essential oil in samples of May Chang tree

续表1 (Continued Tab.1)

样本名称Sample name精油含量Essential oil content(%)种名称 Species name拉丁名Latin name采集日期 Harvest timeF81.82毛山鸡椒L.cubeba var.formosana2017.8.16F101.83毛山鸡椒L.cubeba var.formosana2017.8.17F111.85毛山鸡椒L.cubeba var.formosana2017.8.17

1.1.2 供试病原菌

枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.fordii1)取自油桐枯萎病病发区，病原菌经分离、纯化后，形态和分子鉴定[10]。大肠杆菌和李斯特菌由浙江科技大学宋大峰博士赠送。

1.1.3 仪器与设备

设备： Agilent-5975B气质联用仪

仪器：精油提取装置、压力蒸汽灭菌锅、干热灭菌器、电热恒温培养箱、旋涡混合器、微波炉、超净工作台、移液器、单反相机等。

1.2 实验方法

1.2.1 山苍子果实精油提取

取新鲜山苍子果实，通过水蒸气蒸馏法分离得到芳香精油。经无水硫酸钠(Na2SO4)干燥后于4 ℃保存备用。各样本单独提取。

1.2.2 三种山苍子各样本精油挥发性成分测定

利用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)，分别对上述山苍子各样本精油进行挥发性成分检测。吸取50 μL精油，溶解在5 mL无水乙醇溶液中，经过无水硫酸钠脱水处理后，上机测定。

GC-MS条件：色谱柱：DB-5MS(60 m×0.25 mm ID×0.25 μm膜厚)。程序升温参数：初始温度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升温至870 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至180 ℃保持1 min，以10 ℃/min升温至230 ℃保持5 min，最后以20 ℃/min升温至250 ℃保持3 min。进样口温度：220 ℃，分流比1∶10，进样量1 μL ，载气为高纯氦气(99.999%)，柱流速：1.5 mL/min。色谱-质谱接口温度：250 ℃。离子源温度：230 ℃。离子化方式：EI。电子能量：70 eV。扫描质量范围m/z50～500。

定性与定量分析：各组分分别与NIST08标准谱库进行检索匹配，并结合文献报道、各成分相对保留时间等进行定性分析。定量分析按峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量。

1.2.3 山苍子精油抑制真菌活性测定

1.2.3.1 精油使用液的配制

用二甲基亚砜(DMSO)溶解待测精油，每种待测精油用量设置5个浓度梯度，分别为6.25、12.5、25、50和100 μL/mL。

1.2.3.2 抑菌率的测定

采用生长速率法测定山苍子精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性。将配制好的PDA培养基分装到组培瓶中，每瓶倒入60 mL，待冷却至 55 ℃左右时，各加入 600 μL的精油使用液，立刻摇匀。混匀后倒入到5个90 mm规格的培养皿中，制成含不同浓度精油的平板。用灭菌的9 mm打孔器在培养好的尖孢镰刀菌平板上打取菌饼，用镊子将菌饼倒贴于上述平板上，28℃培养，分别在 72、96、120、144和168 h按十字交叉法测量菌落直径。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径 - 处理菌落直径)/(对照菌落直径 - 菌饼直径 )×100%

1.2.4 山苍子精油抑制细菌活性测定

采用抑菌圈法测定山苍子精油对大肠杆菌和李斯特菌的抑菌活性。将大肠杆菌培养过夜培养，制备1×107CFU/mL的菌悬液。吸取100 μL菌悬液与5 mL半固体LB培养基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂7.5 g，蒸馏水1 000 mL)混匀后倒入9 mm培养皿中，冷却后形成半固体培养基。将含有20 μL精油使用液的圆形滤纸(直径为5 mm)放入培养基中，每个培养基中均匀放置3个精油滤纸。于37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径。李斯特菌需在脑心浸液肉汤培养基(BHI)中培养，其余实验方法同上。

1.2.5 数据分析

所有试验均保留3～5个重复，利用Excel计算各精油不同浓度不同培养时间下的抑菌率，绘制毒力方程并计算出半最大效应浓度(EC50)和最低抑菌浓度(MIC)数值。通过DPS(Data Processing System)软件，对三种山苍子精油抑菌效果进行显著性分析，对各化学成分与抑菌效果进行相关性分析。采用最小显著性差异检验(LSD)[11]进行方差分析(ANOVA)。利用SPSS软件进行相关性分析，通过R语言(https://www.r-project.org/)corrplot包中的“corrplot()”函数进行相关矩阵分析和可视化作图。

2 结果与分析

2.1 山苍子物种鉴定

对采集到的山苍子进行性状描述并记录，与《中国植物志修订版》(http://foc.eflora.cn/)和中国植物图像库(PPBC http://www.plantphoto.cn/)进行对比，确定其为山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒。还有一未鉴定种，推测其为山鸡椒和红叶木姜子杂交种或变种，在本实验中不做具体研究。以下列出了这些山苍子的植物检索表(表2)。

表2 几种重要山苍子物种检索表Table 2 The plant key of several important May Chang tree species

2.2 山苍子精油对真菌的抑菌性评估

采用十字交叉法测定了山苍子精油不同浓度下从第3天到第7天的菌落直径，再根据菌落直径数据计算出各个样本的菌丝生长抑制率。总的来说，山苍子精油具有较好的抑菌效果，在浓度为1 000 μL/L时，除了F15、C14和F11，其余样本抑菌率都达到了100%。大部分样本精油在浓度为500 μL/L时，抑菌率在90%以上。表3展示了不同样本精油的毒力，其中毒力方程是根据浓度对数和抑菌率的相关性，做出的回归方程。根据毒力方程，当y值为1时，x所对应的浓度就是最低抑菌浓度(MIC)；当y值为0.5时，x所对应的浓度就是半最大效应浓度(EC50)。其中，样本G4、G3和L29精油的EC50最低，分别为0.47、63.32和91.06 μL/L；样本G3、F7和F9精油的MIC最低，分别为265.53、243.13和321.07 μL/L。

表3 三种山苍子各样本精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性分析Table 3 The inhibitory activities of essential oil from three kinds of May Chang trees against Fof-1

2.3 三种山苍子精油抑制真菌活性评价

尖孢镰刀菌在培养到第7天后记录菌落形态，发现山鸡椒精油培养基中的菌落直径最小，其次是毛叶木姜子和毛山鸡椒。为进一步确定三种山苍子精油对尖孢镰刀菌的抑菌差异性，本研究对每个物种选择3个家系的精油作为生物学重复进行精油含量、MIC和EC50分析。结果如表4所示，山鸡椒精油含量为7.70%，显著高于毛叶木姜子(3.09%)和毛山鸡椒(2.14%)。山鸡椒MIC和EC50浓度分别为499.44和54.88 μL/L，毛叶木姜子MIC和EC50分别为1479.10和110.21 μL/L，毛山鸡椒MIC和EC50分别是638.72和149.19 μL/L，结果表明，山鸡椒MIC显著低于毛叶木姜子，EC50显著低于毛山鸡椒，证明山鸡椒果实精油含量以及精油抑制真菌效果都显著优于其他两个物种。

表4 山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒精油对尖孢镰刀菌抑菌效果的显著性分析Table 4 The significant analysis on inhibitory effect of L.cubeba,L.mollis and L.cubeba var.formosana essential oil against Fof-1

注：*用小写字母表示5%显著性。如果一个处理为“a”，那么所有包含“a”的处理之间没有显著差异，而不包含“a”的处理之间存在显著差异。

Note:*The lowercase letters are used for 5% significance.If one dispose is treated as “a”,there are no significant difference among all the treatments containing “a”,and there are significant differences among all treatments that do not include “a”.

2.4 三种山苍子精油抑制细菌活性评价

为了进一步探究三种山苍子对细菌的抑菌活性，本研究分别选择3个家系精油作为生物学重复进行抑制大肠杆菌和李斯特菌效果的分析。三种山苍子精油抑菌圈直径如表5所示，结果显示三种山苍子精油对大肠杆菌和李斯特菌都表现出抑菌活性，特别是对大肠杆菌的抑菌活性优于李斯特菌。根据抑菌圈试验判定标准 ：抑菌圈直径大于 20 mm，极敏 ；16～20 mm，高敏 ；11～15 mm 中敏 ；8～10 mm，低敏 ；小于 8 mm，不敏感[12]。当浓度为100 μL/mL时，大肠杆菌对山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒都表现出对极敏感性；当精油浓度为50 μL/mL时，对山鸡椒和毛叶木姜子表现出极敏感性，毛山鸡椒为高敏；浓度在25 μL/mL或以下时，大肠杆菌对三种山苍子精油都表现出中敏或低敏感性。而李斯特菌在精油浓度为100 μL/mL时，对山鸡椒表现出极敏感性，对毛叶木姜子和毛山鸡椒表现出高敏和中敏感性；当浓度为12.5 μL/mL时，对毛叶木姜子和毛山鸡椒表现出低敏感性。整体上看，三种山苍子精油对大肠杆菌的抑菌效果相近；山鸡椒对李斯特菌的抑菌效果要优于毛叶木姜子和毛山鸡椒。

表5 三种山苍子精油不同浓度下对大肠杆菌和李斯特菌的抑菌活性分析Table 5 The antibacterial activity of three kinds May Chang tree essential oil against E.coli and L.monocytogenes at different concentrations

2.5 山苍子精油化学成分分析

本研究对三种山苍子各样本精油进行了GC-MS检测，每个样本鉴定得到的成分占总成分的97%以上。由于各样本精油化学成分含量差异性较大，只对各物种的代表样本进行展示。三种山苍子精油成分的化学式和成分含量如表6所示，橙花醛和香叶醛是山鸡椒、毛山鸡椒和毛叶木姜子的最主要成分，其中山鸡椒橙花醛和香叶醛的含量最高，分别占39.97%和50.00%。

表6 三种山苍子精油化学成分及百分含量分析Table 6 The analysis of chemical compositions and percentage contents in three kinds May Chang tree essential oil

续表6(Continued Tab.6)

化学成分Chemical composition中文名称Chinese name化学式Chemical formula含量Content(%)山鸡椒L.cubeba毛山鸡椒L.cubeba var.formosana毛叶木姜子L.mollis6-Octen-1-ol,3,7-dimethyl-,(R)-(R)-3,7-二甲基-6-辛烯醇C10H20O0.10Cyclohexanemethanol,4-hydroxy- .alpha.,.alpha.,4-trimethyl-对薄荷烷-1,8-二醇C10H20O20.10Caryophyllene石竹烯C15H240.481.430.61Caryophyllene oxide石竹烯氧化物C15H240.040.01(-)-β-Elemeneβ-榄香烯C15H26O0.63(E)-β-Farnesene (E)-法呢烯C15H26O0.05Naphthalene,decahydro-1,5-dimethyl-1,5-二甲基-十氢萘C11H180.044-terpene alcohols4-萜烯醇C11H20O0.052-Cyclohexen-1-one, 4-(2-oxopropyl)-4-(2-氧代丙基)-2-环己烯-1-酮C17H28O20.973-Cyclopentene-1-acetaldehyde,2-oxo-2-氧代-3-环戊烯-1-乙醛C18H24O20.255-Hepten-2-one甲基庚烯酮C6H10N20.150.050.39Cyclohexane,(1-methylethyl)-异丙基环己烷C9H180.13

注：“/”表示未检测到。

Note:“/” indicates not detected.

2.6 山苍子精油差异成分与抑菌效果相关性分析

为了进一步探究山苍子精油化学成分与抑菌效果的关系，本研究对各样本山苍子精油差异成分与MIC进行了初步的相关性分析。结果如表7所示，香叶醛与MIC呈显著负相关关系，橙花醛与MIC呈极显著负相关关系，石竹烯与MIC呈极显著正相关关系，其余各成分与MIC的相关性较低。相关性分析结果表明，山苍子精油中香叶醛和橙花醛含量与抑菌效果呈现显著正相关关系，石竹烯含量与抑菌效果存在负相关关系。

表7 山苍子精油差异成分与最低抑菌浓度的相关性分析Table 7 The correlation analysis between the chemical components of essential oil and MIC

续表7(Continued Tab.7)

中文名称Chinese name英文名称English name最低抑菌浓度 MIC皮尔逊相关性Pearson correlation 显著系数Significance coefficient 个案数Number of case桉叶油素Eucalyptol0.4610.2514胡椒酮Piperitone0.8050.194-萜烯醇3-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)--0.0240.9699茨醇Borneol-0.2410.6969环氧蒎烷3-Oxatricyclo [4.1.1.0(2,4)] octane,2,7,7-trimethyl-0.0010.9989石竹烯Caryophyllene0.800∗∗0.0115石竹烯氧化物Caryophyllene oxide0.7460.08810柠檬二乙缩醛Citral diethyl acetal0.8750.0529

注：*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:*P< 0.05;**P< 0.01.

根据对山苍子精油差异成分与MIC的相关性分析，本研究进一步筛选出山苍子精油中的几种主要成分进行各成分、抑菌率以及精油含量之间的相关性分析。山苍子精油主要的化学成分为柠檬醛(橙花醛+香叶醛)、柠檬烯、石竹烯、香茅醛、芳樟醇和松油醇(表6)，将这6种主要成分与菌丝生长抑制率和精油含量进行相关性分析。如图1所示，柠檬醛和芳樟醇含量与抑菌率呈现显著(显著性水平α=0.05)正相关性，相关系数分别为0.342和0.333；柠檬醛含量与精油含量呈现显著正相关关系，相关系数为0.391；柠檬烯和石竹烯含量与柠檬醛的含量呈现极显著(显著性水平α=0.01)负相关关系，相关系数分别为-0.496和-0.664。

图1 山苍子精油主要化学成分、精油抑制率和精油含量之间的相关性分析Fig.1 The correlation analysis among the main chemical components of essential oil,inhibition rate and essential oil content. 注：* P < 0.05；** P < 0.01。Note:* P < 0.05;** P < 0.01.

3 结论

3.1 山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒精油抑菌性效果评价

本研究中山苍子精油具有广谱的抑菌性，与文献报道[7]一致，特别是山鸡椒精油抑制真菌的效果最好，其EC50为54.88 μL/L。毛叶木姜子和毛山鸡椒精油的EC50均低于先前报道[13](EC50=379.4 mg/L)。山鸡椒和毛山鸡椒精油的MIC分别为499.44和638.72 μL/L，均低于先前报道[14]的山苍子精油抑制真菌的 MIC(1 000 μL/L)。此外，山鸡椒精油在浓度为125 μL/L时，对尖孢镰刀菌的抑菌率大于50%，异樟叶(异一橙花叔醇)精油被报道浓度在166 μL/L时抑菌率为42.64%，山鸡椒精油抑制尖孢镰刀菌的效果要优于异樟叶抑菌效果[15]。如表5所示，山苍子精油对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的抑制效果优于对革兰氏阳性菌(李斯特菌)，这与Mayaud等[16]先前的结论不同，但与Kumarsaikia等[17]报道的结论一致。三种山苍子精油对大肠杆菌表现出相近且较好的抑菌效果，而山鸡椒精油对李斯特菌的抑制效果要优于毛叶木姜子和毛山鸡椒。总体来说，山鸡椒精油含量和抑菌效果都优于毛叶木姜子和毛山鸡椒，证明山鸡椒可作为山苍子品质油提取和生产的优良物种，亦可作为抗菌和防腐产品研发的原材料。

3.2 山苍子精油成分与抑菌效果相关性分析

本研究中山苍子挥发油化学成分中柠檬醛、柠檬烯、石竹烯、香茅醛、芳樟醇和松油醇为其最主要的化学成分，特别是柠檬醛含量(70%～90%)，这与先前报道具有一致性[18]。在山苍子精油差异成分与MIC的显著性分析中，结果显示只有柠檬醛与MIC呈显著负相关，即与抑菌性成显著正相关；但通过与菌丝生长抑制率进行相关性分析发现柠檬醛和芳樟醇与抑菌性有显著正相关关系。推测芳樟醇与抑菌性存在较高的正相关关系，但由于山苍子精油中柠檬醛含量占据主导地位，导致不同指标下其相关关系的显著性存在一定差异。据报道，单萜柠檬醛和香茅醛已被证明能够抑制真菌的生长，尤其是柠檬醛[19]；芳樟醇R-和S-对映异构单体都具有较好的体外抗菌活性[20]。实验结果支持柠檬醛和芳樟醇含量可作为山苍子挥发油抗真菌活性样本筛选的可靠指标，其中柠檬醛含量为主导。本研究中石竹烯含量与抑菌率表现出显著负相关，但Kim等[21]探究了石竹烯异构体的抗菌活性，证明它们可以抑制金黄色链球菌(Streptococcusaureus)和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)。石竹烯在山苍子精油中与柠檬醛含量显著负相关，推测其可能与柠檬醛合成存在直接或间接地竞争关系。