重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)方法的建立

梁君妮，尹伟力，谢 爽，刘 宁，段效辉，林 森

(烟台海关技术中心，山东 烟台 264000)

鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)属水泡病毒属(Vesiculovirus)，是一种弹状病毒[1]，主要流行于欧洲、中东和俄罗斯，近几年蔓延至美洲和亚洲[2-4]。SVCV 宿主范围非常广泛，四大淡水鱼类均能被感染，其中最易感的为鲤科鱼类，尤其仔鱼，一旦感染死亡率可达70 %[5]。它可以引起鱼类大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)，是世界动物卫生组织(OIE)必须通报的动物疾病。

SVCV 传统的检测方法是细胞培养分离法，但该方法费时费力。近年来检测SVCV 的分子生物学方法被广泛研究并应用。其中重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)方法可以在25 ℃～42 ℃恒温条件下20 min 内快速完成核酸扩增，无需昂贵的变温仪器，反应迅速，灵敏度高，扩增产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进行检测[6-8]，适合现场快速检测。本研究依据SVCV G 基因保守序列设计特异性引物，利用RPA 技术建立一种简便高效、特异性强、灵敏度高的SVCV 检测方法，适用于设备简单的基层实验室及现场检测，是SVCV日常监控及检测的有效手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 SVCV 由本实验室保存。传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)和传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)均由深圳出入境检验检疫局提供。80 份临床样品，包括鲤鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼、鲢鱼的肾、脾、肝、肺、脑等组织及各品种鱼苗，均采集自山东地区水产养殖场。RNA 提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；逆转录试剂盒、质粒 DNA 抽提试剂盒、pMD18-T 载体、DL2000 Marker 均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 引物设计 根据GenBank 已登录的SVCVG 蛋白基因(AY527273.1)保守序列，按照RPA 引物设计要求[9-10]设计引物：5'-GTATTTTGGGACGACTGG GAGTTAGATGGC-3'/5'-CATAATGAGGATGAGGGA TAATATCGGCTTG-3'，预期扩增片段为172 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 G 基因重组质粒标准品的构建与鉴定 利用RNA 提取试剂盒提取SVCV RNA，利用逆转录试剂盒获得cDNA，核酸蛋白分析仪测定cDNA 浓度。以该cDNA 为模板，参照纪锋等设计的扩增SVCV完整G 基因的引物[11]进行PCR 扩增，将PCR 产物回收并连接 pMD18-T 载体， 构建重组质粒pMD18-G，阳性重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。鉴定阳性后提取质粒，测定重组质粒浓度，计算拷贝数。

1.4 RPA 方法的优化 建立50 μL RPA 反应体系：向装有重组酶及聚合酶的反应管中加入25 μL 反应缓冲液(2×)、上下游引物(5 μmol/L)各 4 μL 以及 2.0 μL模板DNA，双蒸水补至总体积为47.5 μL 后充分混匀，加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸镁溶液并混合均匀。本研究共设计5 个温度梯度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、42 ℃)，确定最优反应温度。同时设空白反应管，放置于37 ℃金属浴内反应20 min。反应结束后产物经电泳分析确定最优反应温度。

1.5 RPA 方法特异性试验 利用RNA 提取试剂盒提取SVCV、IHNV、EHNV、VHSV、IPNV 的RNA，反转录获得cDNA 作为模板，利用建立的RPA 方法分别进行检测，对该方法的特异性进行评价。

1.6 RPA 方法灵敏度试验 以倍比稀释的重组质粒 pMD18-G (105拷贝 /μL～100拷贝 /μL)作为模板，按照优化后的条件进行RPA 反应，确定该方法的敏感性。同时参考行业标准《SN/T 1152-2002 鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录- 聚合酶链式反应(RTPCR)检测方法》[12]对上述重组质粒进行RT-PCR 检测，比较两种方法的检测结果。

1.7 临床样品的检测 对采集自养殖场的临床成鱼组织样品及鱼苗按常规方法处理后提取基因组，参照1.3 方法获得cDNA，分别以其为模板利用建立的RPA 方法进行检测，同时利用RT-PCR 方法[12]检测，比较二者结果。

2 结 果

2.1 G 基因重组质粒标准品的鉴定 对构建的重组质粒标准品进行PCR 鉴定，结果显示得到一条约1 500 bp 的目的片段，与预期相符(图1)，表明正确构建了重组质粒pMD18-G。用核酸蛋白分析仪测定质粒浓度并经公式计算得出重组质粒拷贝数为8.92×1010拷贝 /μL。

2.2 SVCV RPA 方法的建立 共设计5 个温度梯度，以确定最优反应温度，结果显示扩增温度在25 ℃～42 ℃范围内均可扩增出约170 bp 的特异性目的条带，当扩增温度为35 ℃、40 ℃、42 ℃时，扩增产物出现微弱的非特异性条带，而扩增温度为30 ℃的特异性条带比25 ℃更清晰明亮(图2)，因此最终确定30 ℃为SVCV 的最优扩增温度。

2.3 RPA 方法的特异性试验结果 利用建立的RPA 方法对SVCV、IHNV、EHNV、VHSV、IPNV病毒的cDNA 进行检测，结果显示仅有SVCV 在约170 bp 处出现明显的特异性条带，其它4 种病毒均未出现特异性扩增条带(图3)。表明建立的RPA 方法具有较强的特异性。

2.4 RPA 与PCR 方法灵敏度试验结果 以倍比稀释的重组质粒 pMD18-G (8.92×105拷贝 /μL～8.92×100拷贝 /μL)为模板，进行灵敏度试验，并与RT-PCR 方法进行比较，结果显示RPA 方法的检测下限为89.2 拷贝/μL，高于RT-PCR 方法的检测下限 8.92×102拷贝 /μL (图4)，表明 RPA 方法比 RTPCR 方法具有更高的灵敏度。

2.5 临床样品的检测 应用已建立的RPA 方法和RT-PCR 方法对80 份临床样品进行检测，结果显示：RPA 方法与RT-PCR 方法检测结果一致，共计13 份阳性样品，但 RT-PCR 有 2 份弱阳性(表1)，表明RPA 方法可以有效的检出RT-PCR 方法的弱阳性样品，因此RPA 方法比RT-PCR 方法具有更高的临床应用价值。

表1 RPA 方法和RT-PCR 方法对临床样品检测结果Sample types Number positive samples量f negative samples RPA鲤鱼Cyprinus carpio草鱼Ctenopharyngodon idellus青鱼Mylopharyngodon piceus鲢鱼Hypophthalmichthys molitrix鳙鱼Aristichthys nobilis 25 RPA 19 RT-PCR 19 18 RT-PCR 6 (1 weakly positive)21616 143 (1 weakly positive)1111 131111 10 6 2 3 2 0 2 0 1010

3 讨 论

鲤春病毒血症作为农业部规定的一类动物疫病，是口岸检疫的一类检疫对象。除常规的细胞培养法，近些年很多专家学者建立了多种SVCV 的分子生物学检测方法，但相比经典核酸检测技术，RPA 技术检测耗时短，20 min 即可完成，在常温恒温下即可进行，灵敏度高，结果读取简便、多样化[13]。RPA 技术作为新兴起的恒温扩增技术，近几年被广泛应用于转基因、医学病原菌、动物疫病病原等的快速检测。邓婷婷等建立了转基因水稻中Cry1Ab/c基因的RPA 检测方法，直接在37 ℃恒温条件下快速检测转基因水稻中Cry1Ab/c 基因[14]；刘立兵等建立的猪细小病毒的RPA 快速检测方法在38 ℃恒温反应30 min[15]。RPA 方法的最适温度在25 ℃～42 ℃，本研究经优化确定30℃为最优反应温度。

RPA 方法的核心是引物设计，但目前无专门的软件可供使用。一是RPA 方法引物长度要在45 bp以内，最佳长度为30 bp～35 bp，引物长度太短会降低与重组酶的结合率，影响扩增速度，但是较长的引物设计时更易出现回文序列、连续重复序列以及发卡结构，设计难度增大。二是扩增DNA 片段的选取，RPA 通常扩增长度为80 bp～400 bp 才有较高的敏感性和特异性，且扩增长度为100 bp～200 bp 效果最佳[16]。本研究基于SVCV 的G 基因保守序列设计引物，建立了SVCV 的RPA 快速检测方法。

利用本研究建立的RPA 方法对山东地区养殖场采集的80 份临床样品进行检测，采集样品涉及最易感染SVCV 的鲤鱼、草鱼、青鱼、鲢鱼、鳙鱼等国内主要养殖淡水鱼类，其中鲤鱼感染率最高(6/25)。将检测结果与常规的RT-PCR 方法进行比较，表明RPA 方法对于RT-PCR 方法的弱阳性样品有较高的检出率，且检测结果与RT-PCR 方法完全一致，从而证明了RPA 方法的高灵敏度。而RT-PCR 方法检出的弱阳性样品浓度过低无法有效测序，因而不能作为病毒阳性结果确定的依据。

本研究建立的RPA 方法特异性强、灵敏度高、反应快速、操作简便、成本低廉，是快速检测SVCV 的有效手段，适用于基层养殖单位和口岸部门现场检测，具有广阔的应用前景。