大熊猫自然保护区(栗子坪)周边区域病毒病和蠕虫病流行病学调查

赵九洲，胡 潇，李 丹，李财源，文翼平

(四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130)

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的濒危物种，截至2013年底，全国野生大熊猫种群数量达1 864 只，圈养大熊猫种群数量达到375 只，与之前的调查相比，野生及圈养大熊猫种群数量均稳定增长[1]。尽管这表明中国政府和其它相关单位一直在努力保护和增加大熊猫的数量，但传染病和寄生虫病仍然威胁着大熊猫的生存。

近年来，国内有大熊猫感染病毒及寄生虫后发病乃至死亡的报道。胡贵学等首次报道大熊猫感染犬瘟热病毒(CDV)致死性感染[2]。邬捷等对成都、重庆两地动物园的大熊猫进行血清学调查，首次证实大熊猫能够自然感染犬细小病毒(CPV)[3]。王成东等首次从成都大熊猫繁育研究基地多只大熊猫幼仔的腹泻粪便中分离获得病毒粒子，并鉴定该病毒为轮状病毒[4]。一些在犬科动物中发生与流行的蠕虫病也对大熊猫种群构成潜在威胁[5-8]。然而，由于野生大熊猫的相关样品采集存在很多障碍，想要做到实时监控大熊猫群体内感染疫病的流行情况十分困难。因此，做好传染源的控制工作对预防大熊猫相关疾病的发生具有重要的意义。在栗子坪大熊猫自然保护区，人类的居住地与保护区交错，家犬在保护区周边随处可见，增加了这些疾病传播的可能性。本实验分别利用间接ELISA 检测法及饱和氯化钠浮选法对4 种犬常见病毒和蠕虫感染情况进行调查，为更全面、更完善地做好野生大熊猫以及放归大熊猫的疾病防控工作提供流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 采自 2016年12月～2017年12月栗子坪自然保护区周边6 个行政村(大兴、公益、联合、孟获、竹马和紫马)172 份犬血样以及3 个行政村(公益、竹马和紫马)66 份犬粪样。

1.2 主要试剂 CDV、CPV、狂犬病毒(RV)、犬轮状病毒(CRV)ELISA 抗体检测试剂盒均购自CUSABIO 公司。

1.3 犬的饲养状态及体型统计 2016年12月～2017年12月选取栗子坪大熊猫自然保护区周边距离保护区较近的6 个行政村，通过询问、实地走访调查等方式对养狗村户了解家犬饲养状态，利用卷尺、体重秤测量犬的身长体重并记录。

1.4 犬血样的间接ELISA 抗体检测 按照各病原ELISA 抗体检测试剂盒说明书分别检测采集的172份犬血样的CPV、CDV、CRV、RV 抗体。根据实验结果统计各病原的阳性率、混合感染、感染日龄、感染季节。

1.5 犬粪样中蠕虫的检测 采用饱和氯化钠浮选法结合镜检检测犬粪样中蠕虫种类。

1.6 犬粪样中蠕虫感染强度的检测 取采集到的新鲜粪样少许，编号，将粪便加入适量饱和食盐水充分混匀，用两层纱布过滤，3 000 r/min 离心3 min，用接种环沾取表面液膜，涂布于载玻片上，加盖玻片，镜检。判定标准：每张涂片中，同一种虫卵1 ～3 个 为 “ +”， 4 ～7 个 为 “ ++”， 8 ～11 个 为“+++”，12 个以上为“++++”。根据寄生虫图谱和有关资料对虫卵和卵囊进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 犬的饲养状态及体型统计结果 对保护区周边6 个行政村的368 只家养犬进行调查统计，调查结果显示，63.9 % (235/368)的犬是自由散养状态，36.1 % (133/368)的犬活动受限，24.5 % (90/368)的犬为超小型犬(＜4 kg，＜25 cm)，29.6 % (109/368)的犬为小型犬(5 kg～10 kg，26 cm～40 cm)，42.2 %(155/368)的犬为中型犬(11 kg～30 kg，41 cm～60 cm)，3.7 % (14/368)的犬为大型犬(31 kg～40 kg，61 cm～70 cm)。结果表明，保护区周边村户多数家养犬呈自由散养状态，且以具有一定移行能力的中小型犬类为主(71.8 %) (表1)。栗子坪大熊猫自然保护区处于本实验调查的6 个行政村犬的活动范围内，通过问询，了解到该区域家养犬大多未做常规免疫，而据保护区工作人员介绍，保护区内常可见犬的排泄物及脚印。以上调查结果可证明有相当数量的家养散放犬进入保护区内，且存在传播病原的可能性。

2.2 犬血样中几种病毒抗体的间接ELISA 检测结果 采用间接ELISA 方法，对研究区域内采集到的172 份犬血样进行检测，检测结果显示，21 %的犬至少有一种病毒抗体呈阳性，其中CDV、CPV、RV 和CRV 抗体阳性率分别为4.7 % (8/172)、3.5 %(6/172)、12.8 % (24/172)、3.5 % (6/172)。由于本次流行病学调查位于大熊猫自然保护区周边区域，具有特殊的地域性，因此保护区所在的相关疫病的流行病学调查数据具有重要的参考意义。RV 抗体阳性率低于侯巍等报道[9]，CDV、CPV 抗体阳性率明显低于张昕[10]、陈珍容[11]所报道，以上报道主要是城市地区家养犬的相关流行病学数据，而本次检测对象为乡村家养犬，推测由于检测区域疫苗接种免疫普及程度不同导致结果差异。

2.3 犬血样中病毒混合感染情况统计 对检测结果呈阳性的44 份血样进行CDV、CPV、CRV、RV 混合感染情况的统计，结果显示，RV 与CDV 混合感染率为9.1 % (4/44)，其与CPV 混合感染率为9.1 %(4/44)，其与CRV 混合感染率为4.5 % (2/44)，CDV与CRV 混合感染率为6.8 % (3/44)，未检测出CPV与CDV、CPV 与CRV 混合感染情况。未检测有赵战勤[12]、诸明涛[13]等报道的CDV 与CPV 的混合感染，可能与样本数量及地域差别有关。因此，该地区疾病防控重心在于控制RV 的感染与流行。

2.4 抗体阳性犬年龄分布统计 对检测结果为阳性的犬进行年龄统计，结果显示，CDV、CPV、CRV主要感染1 岁以下的犬，比例均占50 %以上。各个年龄段的犬均存在不同程度RV 感染，且2 岁以上的犬居多(表1)。统计结果与张昕等人的报道基本一致[10-11,14-15]。降低相关传染病流行风险的有效方式在于做好犬的常规免疫工作，尤其需要重视1 岁以下犬的免疫情况。

表1 犬血样中抗体阳性犬年龄分布统计病毒种类Virus types 1～12月龄阳性数Positive No.at the age of 1-12 months Positive No.at the age of 1-2 years Positive No.above 2 years old(%)Positive rates above 2 years old CDV CPV CRV RV 6545 Positive rates at the age of 1-12 months 75.0 83.3 66.7 20.8 2117 Positive rates at the age of 1-2 years 25.0 16.7 16.7 29.2 0011 2 00 16.7 50.0

2.5 感染犬各病原的季节分布统计 各个季节的抗体阳性率显示，CDV 春、秋、冬季感染率较高，占总比例的87.5 %；CPV 在春、秋季感染率较高，分别为50 %和33.3 %；CRV 在冬季感染率较高，为66.7 %；以上3 种病毒夏季感染率较低，分别为12.5 %、0、0；而RV 无明显的季节性(表2)。表明在气候寒冷、温差较大的季节相关传染病发生的几率较高。

2.6 犬粪样中蠕虫感染检测结果 本研究检测了66 份犬粪样，共检出7 种蠕虫，其中犬钩虫的感染率为21%(14/66)，浣熊拜林蛔线虫的感染率为6.1%(4/660)，圆线虫的感染率为9.1 % (6/66)，犬复孔绦虫的感染率为12 % (8/66)，狮弓首蛔虫的感染率为3 % (2/66)，犬弓首蛔虫的感染率为46 % (30/66)，犬鞭虫的感染率为12 % (8/66)。犬钩虫21 % (n=14)和犬弓首蛔虫46 % (n=300)，均存在较高感染率。检测结果表明，对大熊猫可能产生影响的犬钩虫需要引起重视，保护区周边区域家养犬的驱虫措施应更加完善。而胡霖等采集了对雅安市146 只犬粪便，结果显示以球虫和贾第虫感染为主，与本实验相关的蠕虫感染率基本一致[16]，存在的部分差异推测是调查地域不同以及实验方法的差别导致。

2.7 犬粪样中蠕虫感染强度检测结果 本研究在对66 份犬的粪便样本进行蠕虫感染情况检测，发现不同类群的蠕虫感染强度差异很大，但感染的平均强度均在每10 克粪便50 个虫卵以下。犬钩虫、犬复孔绦虫以及犬弓首蛔虫感染强度较高(表3)。尽管蠕虫的感染种类较多样，但感染强度均不大，提前做好犬预防性驱虫工作可以有效地降低其体内蠕虫病对大熊猫的潜在威胁。

表2 犬血样中抗体阳性犬季节分布统计病毒种类Virus types春季阳性数(Positive NO in spring in summer in autumn in winter CDV CPV CRV RV 2315 in spring 25.0 50.0 16.7 41.7 1007 in summer 12.5 00 58.3 2216 in autumn 25.0 33.3 16.7 50.0 3146冬季阳性率(%)Positive rate in winter 37.5 16.7 66.7 50.0

感染强度Infection intensity++++++++++Ancylostoma canium 29%43%14%14%Baylisascaris transfuga 50%0 50%0 Strongyloides 67%0 33%0 Dipylidium caninum 0 25%50%25%Toxascaris leonine 0 100%犬鞭虫Trichuris vulpis 100%00 Toxocara canis 20%40%20%20%000注：同一种虫卵1-3 个为“+”，4-7 个为“++”，8-11 个为“+++”，12 个以上为“++++”。Note: The same eggs for "+" 1-3 eggs,4-7 for "++",8-11 is "+++",more than 12 to "++++".

综上所述，大熊猫在野化放归后难以应对自然环境的变化且不具备较强的抵抗疾病能力[17]。与此同时，多数保护区仍存在管理混乱，工作随意性大的问题，使得保护区内的人口分布不合理，没有为大熊猫的繁衍生息提供广阔的生存空间[18]。面对复杂的动物疫病流行病学背景，以上因素均增加了大熊猫对敏感病原甚至跨物种疾病感染的风险。因此，适时的进行相应区域流行病学调查，有助于全面掌握疫病流行情况，为相关疫病的综合防控提供数据。与此同时，建议让公众知晓，未接种疫苗的犬可能会对当地野生动物造成严重的危胁，继而造成持续性不良影响。同时鼓励基层政府及管理部门与村民合作，对区域内家养犬进行必需的驱虫和重要传染病免疫工作，并鼓励对犬的自愿绝育计划，总体抑制犬数量，从根源上降低病毒病与蠕虫病对大熊猫生存健康的威胁。