猪源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定与部分生物学特性分析

江地科，项明源，王 印，姚学萍，杨泽晓，张鹏飞，廖倡宇，朱光恒，姜睿娇

(1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种成短链或长链的革兰阳性菌，菌体呈杆状，属芽孢杆菌科，存在于土壤、灰尘、污水、饲料、植物和各类生熟食品中[1]，该菌以引起人食物中毒最为常见[2]，除感染人以外，还可引起奶牛乳房炎和子宫内膜炎、犬猫腹泻和罗非鱼死亡等，给养殖业和食品安全带来严重危害[3-4]。已有关于猪源B.cereus分离的研究，由于分离时间较早，且未对其危害做系统分析，加之近年来广谱抗生素的大量使用，导致临床分离菌株耐药性不断增强[5]，从而对该病的治疗造成了很大困难。

2017年11月，本研究对四川遂宁某规模化猪场送检3 只因腹泻死亡的哺乳仔猪进行检测，剖检发现死猪腹腔有大量淡黄色腹水、消化道严重出血、肺脏和心脏等器官有白色点状坏死灶，PCR 检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸阳性。对病死哺乳仔猪进行常规微生物学检测，在其心脏组织中分离到一株细菌，将其命名为SN1711，并对该菌株进行分离纯化、生化试验、16S rRNA 扩增测序、动物试验、药敏试验以及耐药基因的PCR 扩增分析，为该病的临床诊断和治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 分离菌株由本实验室分离自2017年11月四川遂宁某猪场送检3 只因腹泻死亡的哺乳仔猪。

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基、MH 培养基、微量生化试管、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒均购自四川博大科技实业总公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、质粒DNA 提取试剂盒均购自TIANGEN公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；SPF 健康昆明小鼠(体质量18 g～22 g)购自四川达硕生物科技有限公司。

1.2 分离菌株的生化试验 分离菌株接种于TSA培养基，经37 ℃，24 h 培养后通过平板划线法进行细菌纯化，挑取纯化后的单个菌落接种于生化鉴定管中，37 ℃培养24 h 后，观察结果。

1.3 分离菌株的16S rRNA 基因的扩增及系统发育树构建 参考文献[6]中的方法，进行细菌基因组DNA 的提取和16S rRNA 基因扩增，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果经BLAST 比对分析，选取GenBank 中已登录的B.cereus16S rRNA 基因序列进行同源比对，采用MEGA6.0软件中Neighbor-joining 方法构建其进化树。

1.4 分离菌株的小鼠致病性试验 将纯化菌株接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中，37 ℃培养24 h后，调整菌液浓度至1×109cfu/mL。将12 只小鼠随机分成2 组，每组6 只，第一组为实验组，每只腹腔注射0.2 mL 菌液；对照组每只注射0.2 mL 生理盐水。连续观察小鼠生理状况和死亡情况，及时对发病死亡小鼠记录及解剖观察，同时按照上述方法进行细菌的分离鉴定。

1.5 分离菌株的药敏试验及耐药基因PCR 检测参照CLSI 推荐的K-B 纸片扩散法进行药敏试验，评定菌株的药物敏感特性，确定耐药谱。以分离菌株的纯培养物为模板，选取β-内酰胺酶类耐药基因(BLA-shv[7]，BLA-ctx[7]，BLA-tem[8]，BLA-oxa[8])和万古霉素耐药基因(vanA[9]，vanB[10])进行相关特异性耐药基因的检测，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并对测序结果进行BLAST 分析。

2 结果与讨论

2.1 分离菌株的生化试验结果 经生化鉴定显示，SN1711 菌株能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不发酵木糖、棉子糖、果胶糖、乳糖和甘露醇。过氧化氢酶试验、乙酰甲基甲醇试验(VP)、甲基红试验(M.R)试验、精氨酸双水解酶试验和明胶试验阳性，硫化氢试验和吲哚试验阴性，且与其他报道的猪源分离株生化特性一致[11]。

2.2 分离菌株的16S rRNA 扩增及序列结果分析将分离菌株进行16S rRNA PCR 扩增，在约1 500 bp处有一特异性条带。将其测序结果进行BLAST 比对， 结果显示该菌株与B.cereus(JN700160.1、JN700144.1、KF494191.1)的相似度均为98 %。选取同源性高的芽孢杆菌、不同来源的B.cereus、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的16S rRNA 基因序列构建系统进化树进行分析，结果显示SN1711菌株与B.cereusB158(KF494191.1)位于同一分支(图1)，且同源性高为98.13 %，结合培养特性和生化试验，鉴定SN1711菌株为B.cereus。

2.3 分离菌株的小鼠致病性试验结果 实验组小鼠注射菌液6 h 后，部分小鼠出现精神沉郁、嗜睡、被毛竖立、食欲废绝，体温上升至37.6 ℃～39.5 ℃，对照组无异常。8 h 后部分小鼠出现死亡，剖解发现肠道有轻微充血。24 h 后小鼠全部死亡，剖解小鼠发现肝脏肿大，肺脏边缘有出血，取内脏器官进行细菌分离，革兰染色镜检、16S rRNA 基因PCR扩增、生化试验鉴定，结果与SN1711 菌株一致，对照组的小鼠未见发病或死亡。表明，本试验分离菌株对小鼠的致病力强。

推测B.cereus发生感染并致病的原因如下：1)该菌作为条件致病菌，广泛存在于猪场环境中，猪体因某些不良因素(饲料来源和水源污染、环境温度、应激及其他病原感染等)导致猪机体内稳态扰乱及免疫力下降，引发该菌继发性感染，使猪群发病。2)由于猪场存在对抗生素滥用及给药方式不当，导致临床治疗失败。

2.4 分离菌株的药敏试验结果 通过对SN1711 菌株药物敏感性检测，结果显示分离菌株对庆大霉素、四环素、头孢哌酮、诺氟沙星等12 种药物高度敏感，对哌拉西林、头孢拉定、多西环素中度敏感，而对青霉素、阿莫西林、头孢他啶、万古霉素等11 种药物耐药(表1)。

对分离菌株SN1711 进行耐药基因PCR 检测。结果显示，仅β- 内酰胺酶类的BLA-tem基因条带阳性，长度为569 bp (图2)，测序结果经BLAST 分析显示与 NCBI 中登录的BLA-tem基因序列(GQ404376.1)相似度为99.63 %，其它5 种耐药基因的扩增结果均为阴性。结果表明SN1711 菌株中BLA-tem为主要耐药基因型，且与耐药表型基本一致。

表1 B.cereus 药敏试验结果庆大霉素Gentamicin卡那霉素Kanamycin妥布霉素Tobramycin四环素tetracycline多西环素Doxycycline青霉素penicillin哌拉西林Piperacillin氨苄西林Ampicillin阿莫西林Amoxicillin头孢噻吩Cefalotin头孢他啶Ceftazidime头孢哌酮Cefoperazone头孢噻肟Cefotaxime头孢拉定Cefradine氧氟沙星Ofloxacin诺氟沙星Norfloxacin恩诺沙星Enrofloxacin多粘菌素BPolymyxin B氯霉素Chloramphenicol复方新诺明Cotrimoxazole林可霉素Lincomycin万古霉素Vancomycin呋喃唑酮Furazolidone红霉素Eryphilin氟苯尼考Florfenicol链霉素Streptomycin 10 30 10 30 30 10U 100 10 20 30 30 75 30 30 5 10 10 30 30 25 2 30 300 5 30 10 20 20 21 18 15 0 18 092 2 0011 2 16 20 21 18 0 20 0001 801 9 17 SSSSIRIRRRRSRISSSRSRRRSRSS注：S：敏感；I：中度敏感；R：耐药。Note: S: Sensitivity; I: Intermediate sensitivity; R: Resistance

已有的研究表明BLA-tem型β- 内酰胺酶是目前世界上种类最多的质粒编码的丝氨酸蛋白酶，主要是通过水解青霉素和头孢菌素的β-内酰胺环，使这些抗生素失活并使细菌存活和增殖[12-13]。同时，这些酶的基因可能存在于细菌的染色体中或通过质粒交换、编码基因发生突变等多种方式导致细菌多重耐药。随着β-内酰胺类抗生素的使用，特别是第3 代头孢菌素用量的不断增加，及兽医临床上抗菌药物的不规范使用，促进了携带β-内酰胺酶基因的质粒、转座子、整合子、基因盒等可移动元件迅速实现耐药基因在不同菌株间的传播，致使细菌对β-内酰胺类药物的耐药性增加[14-15]。因此，监测菌株中的β-内酰胺酶基因具有重要意义的。