利用酸法水解豆粕小肽工艺研究

■谭敬仪 曹志勇 黄 伟 熊思然 郑 跃 余开文 陶琳丽，3 杨秀娟，3*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.云南农业大学基础与信息工程学院，云南昆明650201；3.云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明650201）

我国是世界上大豆生产量最大的国家之一，大豆的资源非常丰富。其中豆粕蛋白含量一般在40%～50%之间，豆粕在饲料中的应用方法主要有：一是作为蛋白原料直接添加，二是酶解豆粕和发酵豆粕，即利用现代生物技术将大豆蛋白通过蛋白酶酶解或微生物发酵降解为可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。然而，在20世纪70年代，研究发现含2个和3个氨基酸的小肽是蛋白质水解的主要产物，含2或3个氨基酸残基的小肽可以通过载体直接被吸收。许多试验证明，蛋白质在降解为氨基酸的过程中产生的中间体小肽可被动物体直接吸收。而蛋白质的水解方法有三种，分别是化学水解法、酶水解法和微生物发酵法。化学水解法分为酸水解法和碱水解法两种水解方法，其优点就是水解的工艺流程简单、成本低廉、酸和碱容易购买、操作简单。本试验以豆粕为原料，探索盐酸水解方法制备2～3个氨基酸组成的小肽的工艺条件，并通过正交试验以期获得最优水解工艺条件，为豆粕的深加工利用研制出一种既营养丰富，又安全可靠的小肽产品，为今后豆粕深加工和综合利用提供科学的方法和依据供参考。

1 材料与方法

1.1 豆粕

购至金田园饲料有限公司，进行粉碎后供水解使用。

1.2 试验仪器

半自动凯氏定氮仪(SKD-1000)，上海沛欧分析仪器有限公司。pH计（pHS-3D），上海精密科学仪器有限公司；冷冻干燥机FD-1C-50，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试剂

中性甲醛溶液（36%）：应不含有聚合物，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH值为7.0。

0.1 mol/l硫酸标准滴定溶液。

1.4 方法

试验采用正交试验设计，对水解时间（4、6、8 h）、盐酸浓度（2、4、6 mol/l）、料液比（1:4、1:5、1:6）三个因素三个水平的正交试验设计，共9组，见表1。

表1 正交试验设计表L9（33）

式中：氨基态氮采用甲醛滴定法进行测定；

总氮含量采用凯氏定氮法进行测定。

从理论计算，当水解液中的水解度为30%～50%之间时，可得到豆粕饲料小肽。

1.4.1 样品制备

取(1.50±0.01) g 豆粕于水解管中，按表1 中添加不同浓度、不同的体积的酸溶液，抽真空后用喷灯将水解管管口封严，置于(110±1) ℃烘箱中水解不同的时间。取出水解管，待其冷却后切开，用定性滤纸过滤至25 ml容量瓶内，定容至刻度。

1.4.2 总氨基态氮的测定

采用甲醛滴定法进行测定，吸取5 ml 水解液，加50 ml水，置于100 ml烧杯中开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/l）滴定至酸度计指示pH 值8.2，加入10.0 ml中性甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/l）继续滴定至pH值9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液(0.05 mol/l)的毫升数。试样中氨基态氮的含量按下式进行计算。

式中：X——试样中氨基态氮的含量（g/ml）；

V1——测定试样加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（ml）；

V2——空白试样加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（ml）；

V3——试样取用量（ml）；

c——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度（mol/l）；

0.014——与1.00 ml 氢氧化钠标准滴定溶液(1.00 mol/l)相当的氮的质量(g)。

1.4.3 总氮含量的测定

采用全量凯氏定氮法，吸取5 ml水解液到消化管底部（不要黏在管壁内），加入0.4 g 无水硫酸铜、6 g无水硫酸钾和10 ml 浓硫酸。 将上一步中的消化管放上小漏斗置于通风橱中电炉上加热消化，开始温度为150 ℃30 min，后调为250 ℃30 min，350 ℃1 h，380 ℃1 h，当消化液变为褐色时将消化管取下冷却，消化到颜色由淡黄色变成透明的蓝绿色并无黑色杂质时。停止消化，待消化管在消化炉中冷却到室温时，取下消化管并加入少量的蒸馏水。接着用全自动凯氏定氮仪进行蒸馏，在蒸馏结束后的硼酸吸收液中滴加1～2 滴甲基红-溴甲酚绿指示剂，用0.1 mol/l 的硫酸标准液滴定，当溶液由蓝绿色变为灰红色为滴定终点，并记下滴定终点时盐酸标准溶液的使用量。

原料中的总氮含量计算公式如下：

式中：X——试样中总氮含量（g/ml）；

V1——滴定试样时所消耗的硫酸体积(ml）；

V2——滴定空白试样时所消耗的硫酸体积(ml）;

V3——试样取用量(ml）；

c——硫酸标准滴定溶液的浓度（mol/l）；

0.014——与1.00 ml硫酸标准滴定溶液(1.00 mol/l)相当的氮的质量（g）。

每个容量瓶做2个平行测定，以其算数平均值为结果。

1.4.4 平均肽链长度（APL）测定

需要测定α-氨基氮含量和总氮（T）含量。用甲醛滴定法测定α-NH2-N 含量，总氮用凯氏定氮法测定。然后计算平均肽链长度，公式如下：

平均肽链长度(APL)=总氮含量/α-氨基氮含量

1.4.5 肽分子平均相对分子质量（PMW）

肽分子平均相对分子质量(PMW)计算公式：

PMW=肽分子平均链长（PCL）×氨基酸平均相对分子质量(氨基酸平均相对分子质量为120)

2 结果与分析

2.1 不同水解条件对豆粕水解度的影响

按照1.4 方法中的正交试验设计，对豆粕进行水解，分别测定水解液中的氨基态氮、总氮，结果见表2。

表2 不同水解工艺水解结果比较分析

从表2中可以看出，水解条件对各处理组间的氮水解回收率、氨基态氮、总氮和水解度影响存在一定的差异，从氮水解回收率看，处理1与其余8个处理间差异显著（P＜0.05），处理2、4与处理7间差异不显著（P＞0.05），处理3、4、5、6、7、8 与处理9 间差异不显著（P＞0.05）；而氨基态氮结果中，处理1、2、3、8分别与其余各处理间差异显著（P＜0.05），处理4与处理7间，处理5、6与处理9间差异不显著（P＞0.05）；从总氮中可以看出，处理1、5与其余各组间差异显著（P＜0.05），处理2、3、4、6、7、8 和处理9 间差异不显著（P＞0.05）；从水解度看，处理1、6、9与其余各处理间差异显著（P＜0.05），处理2与处理5间差异不显著（P＞0.05），与其余各处理差异显著（P＜0.05），处理3、7、8间差异不显著（P＞0.05），处理4、7、8间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同水解条件对豆粕小肽平均肽链长度和小肽平均分子量的影响（见表3）

从表3可以看出，水解条件对各处理间平均肽链长度（APL）、肽分子平均相对分子质量（PMW）有差异，并且都呈现了相同的趋势，处理1、2、5与其余各处理间APL、PMW均差异显著（P＜0.05）；处理3、7与处理8间差异不显著（P＞0.05），与其余各处理间差异显著（P＜0.05）；处理4、7与处理8间不显著（P＞0.05），与其余各处理间差异显著（P＜0.05）；处理6、9间差异不显著（P＞0.05），与其余各处理间差异显著（P＜0.05）。

表3 豆粕小肽平均肽链长度和小肽平均分子量比较分析

小肽是指由2～3 个氨基酸组成的寡肽，从表3 可以看出，处理1、2、5 的平均肽链长度（APL）在2～3 个氨基酸残基之间，满足豆粕小肽所需的肽链长度，其余6 个处理均小于2 个氨基酸残基，不满足豆粕小肽所需的肽链长度，但是处理5的氮水解回收率显著高于处理1和处理2（P＜0.05），所以处理5的水解工艺条件要优于处理1和处理2，即当盐酸浓度为3 mol/l，料液比为1:5，水解5 h 的水解工艺条件下，此时平均链长为2.14 个氨基酸残基，能达到小肽要求的平均肽链长度，即豆粕水解为小肽。

2.3 不同工艺条件对各指标影响的主效应分析

为了比较不同水解条件对氨基态氮含量、总氮含量、水解度、氮水解回收率、平均肽链长度、肽平均分子量等因素的影响的主次顺序，采用极差方法，以极差值大小确定各因素的影响主次顺序，结果见表4。

从表4中可以看出，水解时间、盐酸浓度、料液比三个水解条件对水解度、平均肽链长度、肽平均分子量、总氮四个指标的影响主效应是一样的，即盐酸浓度＞水解时间＞料液比；水解时间、盐酸浓度、料液比三个水解条件对氨基态氮指标的影响主效应即为料液比＞水解时间＞盐酸浓度；水解时间、盐酸浓度、料液比三个水解条件对氮回收率指标的影响主效应即为水解时间＞盐酸浓度＞料液比。极差越大说明该因素的影响也就越大。

3 讨论

本试验研究中所设计的水解时间、盐酸浓度和料液比三个水解条件中，三个条件都是影响试验指标的重要因素，其中盐酸浓度是影响试验指标的主要因素。陈晓刚等（2011）采用响应面分析法对酸水解制备波纹巴非蛤小分子肽工艺进行优化，得到的最优酸水解条件为：固液质量比1:3、盐酸浓度6.4 mol/l、酸水解温度92 ℃、酸水解时间5.3 h，在此条件下肽得率为82.21%，与盐酸浓度固定为6 mol/l 的条件下，随着酸水解温度的升高，肽得率呈先上升后下降的趋势，主要是因为温度过高，小分子肽开始大量地进一步分解为游离氨基酸，导致肽得率下降。在最优工艺条件下，肽得率可达到82.21%。乔伟等（2006）酸水解制备饲料小肽的初步研究中提出本试验结果表明：温度和时间对酸水解程度有较大影响，其中温度的影响更大。适合的水解条件为反应温度90 ℃。反应时间5 h，终产物二肽、三肽含量为19.38%。乔伟等（2006）着重从酸解中的温度因素分析蛋白质水解程度。本试验结果表明的最优豆粕蛋白水解条件为水解时间为4 h、盐酸浓度为3 mol/l、料液比为1:4。试验结果表明的最优豆粕蛋白水解条件为水解时间为5 h、盐酸浓度为3 mol/l、料液比为1:5，造成差异的原因可能是本试验采用的时间与盐酸浓度不同造成试验结果有所差异。

表4 影响各指标的主效应分析

4 结论

水解时间、盐酸浓度、料液比三个水解条件都是影响游离态氮、总氮和氨基态氮、水解度的主要因素，其中盐酸浓度是影响试验指标的主要因素。经过试验得到的结论如下：水解豆粕的最优水解工艺条件为当豆粕水解小肽水解时间为5 h、盐酸浓度为3 mol/l、料液比为1:5时水解度在30%～50%，达到试验目的2～3个氨基酸残基的大豆小肽，氮回收率达到79.59%。