饲料中添加微生态制剂对中华鳖幼鳖生长、消化及生化指标的影响

■贺 刚 方春林* 吴 斌 张志红 王庆萍 王伟萍 邓宏奎 王菊华

（1.江西省水产科学研究所，江西南昌330000；2.江西省科学院生物资源研究所，江西南昌330000）

中华鳖(Trionys sinensis)是重要的淡水特色养殖动物，具有丰富的营养价值和较高的经济价值，随着池塘养殖的迅速扩大和产量不断增加，导致各种疾病随之而来。在养殖过程中，防治水产动物疾病的各类抗生素和化学药物的滥用，出现了养殖废水污染、药物残留超标、产品质量下降等问题，严重影响了中华鳖养殖产业的健康发展。中华鳖产品质量安全问题，也受到广泛的关注，微生态制剂被认为是抗生素的有效替代物之一，通过营养手段提高养殖动物的抗病力已成为研究的热点。微生态制剂具有增强消化酶活性、提升抗氧化功能和改善免疫应答等功能，在一定程度上可增强中华鳖体质，提升个体品质，芽孢杆菌(Bacillus)是一种应用较多的微生态制剂[1]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能以芽孢的形式在各种养殖水体中广泛存在，具有稳定性、耐高温、抗逆性等优点，直接代谢产生多种营养物质并分泌某些酶类，具有促进生长、增强消化、改善内环境、刺激免疫能力、改善养殖水环境等作用，是具有应用前景广阔的益生菌[2-3]，现已应用在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[4]、青鱼(Mylopharyngodon piceus）[5]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[6]、团头鲂(Megalobrama amblycephala)[7]、吉富罗非 鱼（Genetic Improvement of Farmed Tilapia）[8]等多种水产动物，并取得了较好的效果。光合细菌（Photosynthetic Bacteria）是一种厌氧型革兰氏阴性菌，分布于各种养殖水体的缺氧区，含多种维生素、类胡萝卜素、辅酶Q等生理活动物质，能净化养殖水质、吸收有害物质，促进肠道消化吸收，减少鱼类病害发生[9-10]。目前，微生态制剂对中华鳖幼鳖相关影响的研究甚少，本研究以中华鳖幼鳖为对象，通过在基础饲料中添加不同含量的微生态制剂，检测幼鳖的生长性能、消化酶活性、血液生化免疫指标来探讨不同含量微生态制剂对中华鳖幼鳖机体的影响，为中华鳖的饲料运用及苗种培育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和饲料

试验用中华鳖幼鳖购自江西添鹏生态农业公司，挑选初始平均体重（45.54±10.65）g 中华鳖，用5%生理盐水浸泡4～5 min，放入温室水泥池驯养7 d 后，开始进行投喂试验。

按中华鳖对营养成分需求标准为参照，以CP%含58%进口鱼粉、43%膨化大豆、43%豆粕的原料配制基础饲料，原料配比及营养成分见表1。

表1 饲料组成与营养成分（风干，%）

试验用微生态制剂为复合添加剂，主要是沸石粉6.4 kg、麸皮2.8 kg、液体微生物（含枯草芽孢杆菌、光合细菌等）4 kg、壳聚糖（脱乙酰率为95%以上）100 g等物质混合均匀制备而成，测定微生物含量为3亿个/g，pH=6.8。

1.2 试验设计

试验幼鳖随机分为4 组，在基础饲料中添加复合制剂0（对照）、1.5 g/kg（Ⅰ组）、3 g/kg（Ⅱ组）、6 g/kg（Ⅲ组）的试验饲料，每组重复3 次，共12 个池，每池（5.7 m×1.9 m×1.2 m）放养100只，池底铺10 cm细沙，用石棉瓦做晒背台和食台，水深40 cm。试验开始后每日投喂2次，分别在5：00～6：00和17：00～18：00投喂面团状饲料，日投饵量为幼鳌体质量的3%～5%，每组设1个固定投喂点，投喂后2 h清理残饵。养殖期间，用增氧泵不间断增氧，水体pH值7.0～8.0，水温27～30 ℃，每周换水一次，每次换1/3的水。养殖试验进行60 d。

1.3 样本采集与分析

1.3.1 生长性能

养殖结束后，对各池的中华鳖幼鳖进行计数、称重，计算增重率、特定生长率、饵料系数和存活率。

增重率(%)=[(末均重-初均重）/初均重]×100

特定生长率(%/d)=[ln(终末体质量)-ln(初始体质量)]/试验时间×100

饵料系数=摄入干物质质量/(末均重-初均重)

存活率(%)=每池结束存活数量/初始投入数量×100

1.3.2 消化酶活性

称重结束后，将所有试验幼鳖迅速断颈处死，各组选3～5 只取动脉血，4 ℃静置2 h，用于血液生化指标测定。迅速解剖，取出肠道，剔除脂肪，用4 ℃双蒸水冲洗，滤纸吸干多余水分后放入液氮中冷冻2 min，然后置于-80 ℃冰箱中保存，供测酶活性用。

测定酶活性时，将冷冻的肠道4 ℃解冻后称重，加入10 倍体积的4 ℃双蒸水匀浆，然后4 ℃3 600 r/min离心15 min，上清液即为酶粗提液，置于4 ℃冰箱内保存，24 h 内分析完毕。酶粗提液蛋胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.3.3 生化指标

将静置的血液5 000 r/min 离心分离，收集血清，当天测定完成，所有生化指标均在全自动生化分析仪(MD, 美国)上完成。

1.4 数据处理

采用SPSS16.0 软件对试验数据进行数据统计分析，所有数据均用“平均值±标准差”表示。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan's法多重比较分析各试验组间指标的差异，P＜0.05为差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 生长性能（见表2）

表2 复合微生态制剂对中华鳖幼鳖生长性能和饵料系数的影响

添加不同含量复合微生态制剂对中华鳖幼鳖体重、增重率、特定生长率、饵料系数和存活率的影响见表2。试验结束时，Ⅱ组体重和增重率极显著高于对照组和Ⅰ组（P＜0.01）。Ⅱ组特定生长率极显著高于其他试验组和对照组（P＜0.01），饵料系数极显著低于对照组和其他试验组（P＜0.01），而Ⅲ组的增重率、特定生长率均极显著高于对照组和Ⅰ组。饵料系数极显著低于对照组和其他试验组（P＜0.01），Ⅰ组各指标略高于对照组。此外，试验各组的存活率均为100%。

2.2 肠道消化酶（见表3）

表3 复合微生态制剂对中华鳖肠道消化酶活性的影响(U/g prot.)

由表3 可知，添加复合制剂的试验组三种酶活性均高于对照组。Ⅱ组、Ⅲ组的脂肪酶活性显著高于对照组和Ⅰ组（P＜0.05）；Ⅱ组的淀粉酶和蛋白酶活性显著高于其他组（P＜0.05），且Ⅰ组和Ⅲ组差异不显著（P＞0.05）。

2.3 血液生化及免疫指标（见表4）

各试验组的总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均高于对照组，但组间差异不显著（P＞0.05）。各试验组总胆固醇含量逐渐降低，Ⅲ组显著低于对照组（P＜0.05），而其他组间无显著差异。各试验组甘油三酯含量显著高于对照组（P＜0.05），但Ⅱ、Ⅲ组间差异不显著（P＞0.05）；各试验组的尿素氮均低于对照组（P＜0.05）。除Ⅱ、Ⅲ组的IgG低于其他试验组外，各试验组IgA、IgM、IL-2、IL-6的含量均无显著差异（P＞0.05）。各试验组溶菌酶、总抗氧化能力、丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶差异不显著（P＞0.05），而Ⅱ组的谷胱甘肽过氧化物酶高于其他试验组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 复合微生态制剂对中华鳖幼鳖生长性能的影响

本试验结果显示，饲料中添加复合微生态制剂（枯草芽孢杆菌、光合细菌和少量壳聚糖）能促进中华鳖幼鳖生长，提高饲料利用效率，适宜添加量为3 g/kg[11-12]。当添加量为6 g/kg时，中华鳖生长指标和饲料利用有所下降，原因可能是过量微生态制剂造成机体肠道菌群结构失调，还可能是由于产生过量的酶从而抑制有机体内源酶的活性，降低了内源酶对营养物质的降解作用，进一步降低了动物的生产性能[13]。

表4 复合微生态制剂对中华鳖血液生化及免疫指标的影响

Wang[14]在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)饲料中同时添加光合细菌和芽孢杆菌，质量增加率显著提高；鞠守勇等[4]在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)饲料中添加不同含量的枯草芽孢杆菌，试验鱼增重率和特定生长率显著增强；管越强等[15]发现添加枯草芽孢杆菌饲料的中华鳖生长性能高于对照组，饵料系数有所降低。本研究表明，在饲料中添加枯草芽孢杆菌、光合细菌和少量壳聚糖的混合微生态制剂促进幼鳖的生长，在增重率、特定生长率等指标较为显著。一方面芽孢杆菌竞争夺氧维持肠道厌氧环境，阻止有害菌的生长，而光合细菌能改善水体养殖环境，提高有机体的免疫和抗病力，两种细菌共同协作促进了幼鳖消化吸收营养物质的能力；另一方面少量的壳聚糖能维持饲料在水中稳定时间，减少有效成分的溶解损失，促进有机体的生长。

3.2 复合微生态制剂对中华鳖幼鳖肠道消化酶的影响

本试验添加枯草芽孢杆菌、光合细菌和少量壳聚糖等复合制剂后幼鳖的肠道消化酶活性均有所改善，适宜添加量为3 g/kg。鞠守勇等[4]在饲料中添加枯草芽孢杆菌，草鱼肠道中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性均显著高于对照组。黄灵等[16]研究发现在饲料中分别添加芽孢杆菌、光合细菌制剂后，虎龙斑肠道胰蛋白酶、淀粉酶活性显著提高。桂琳等[17]研究表明在饲料中添加1～2 g/kg 复合益生菌，平均体重为（227.48±14.42）g 中华鳖的肠道脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶活性均有所增强。本试验与上述研究结果相似，研究表明，枯草芽孢杆菌、光合细菌和壳聚糖等复合制剂能提高幼鳖肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，作用机制可能是微生态复合制剂引起肠道消化酶的分泌，改善消化道的生理环境，促进了肠道健康发育。另外，本试验结果显示，消化酶活性增强也有限制，因有机体内要维持正常菌群平衡，当复合制剂含量增加到一定程度时酶活性不会持续增强。

3.3 复合微生态制剂对中华鳖幼鳖代谢、免疫及抗氧化指标的影响

血液中各生化指标反映有机体内蛋白代谢和生化免疫的水平程度。总蛋白和白蛋白是重要的营养和健康指示器，前者主要参与多种转运和免疫功能，后者主要为氨基酸的合成提供能量和转运代谢产物[18]。各试验组与对照组的总蛋白、白蛋白含量差异均不显著，可能是试验条件符合幼鳖发育生长，没有感染疾病，饲料营养全面。

甘油三酯、总胆固醇是血液中脂肪的重要组成部分，其含量大小反映出脂类代谢状况。高含量的甘油三酯、总胆固醇会引发有机体的各种疾病，适量的添加枯草芽孢杆菌、光合细菌和少量壳聚糖等复合制剂加强幼鳖中总胆固醇的代谢，降低了胆固醇的含量[4]。试验组中幼鳖血液中甘油三酯含量有所增加是由于复合制剂产生的各种蛋白酶促进肠道对甘油三酯吸收。高密度脂蛋白和低密度脂蛋白是衡量脂类代谢程度的指标[19]，低密度脂蛋白含量过高对机体有害，而高密度脂蛋白含量越高对有机有利，在这两个指标上，各试验组与对照组间总体差异不大。尿素氮指标水平反映肝、肾脏功能的异常程度，各试验组的尿素氮低于对照组，可能是复合制剂促进了蛋白质的沉积，降低了肝、肾中尿素的积累，加快尿素从幼鳖体内的排出，对有机体组织起到特异性保护的作用。

IgA、IgG、IgM 是血清中主要的免疫球蛋白，能维持机体生理平衡和免疫保护作用[6]；白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）均刺激T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，主要参与机体的免疫调节。本试验显示，各组免疫球蛋白指标差异不大，说明饲料营养价值全面，养殖环境单一，幼鳖病害较少。

非特异性免疫是评价幼鳖机体健康程度的重要指标。微生态复合制剂可以刺激机体细胞和体液免疫，产生非特异性免疫因子，主要抗氧化、溶菌酶、补体系统等组成[20]。主要超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内氧自由基的天然去除剂；溶菌酶（LSM）可以清除体内的异物；丙二醛是脂质过氧化反应的最终产物，间接反映出细胞受损程度；谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，主要保护细胞膜的结构完整和功能不受损伤[21-22]。本研究表明，各试验组的多数非特异免疫指标如超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSM）、丙二醛、过氧化物酶含量高于对照组，当添加量为3 g/kg 时，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量显著高于其他组，这可能是因为复合制剂产生的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性增强幼鳖的抗氧化能力，与桂琳等[17]的研究结果相似。

4 结论

在饲料中添加复合微生态制剂（枯草芽孢杆菌、光合细菌和少量壳聚糖）能提高中华鳖幼鳖的增重率、特定生长率，降低饵料系数，增强肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性；同时，能提高幼鳖的非特异性免疫和抗氧化能力，降低无氧代谢水平，增强其抗胁迫能力。复合制剂适宜添加量为3 g/kg。