一株同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的谷氨酸棒状杆菌及其降解特性研究

■唐 彧 张琼琼 郭永鹏 郑雅文 赵丽红

(动物营养学国家重点实验室中国农业大学动物科技学院，北京100193)

霉菌毒素是霉菌生长过程中所产生的有毒次级 代谢产物，其具有致突变性、致畸性和细胞毒性，对动物和人类健康有极大危害，并可造成严重的经济损失。其中，危害较大的两种霉菌毒素为黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）与玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）。黄曲霉毒素毒性最强且分布最广，具有高致病性和较强致癌性，可直接或间接影响人的食品安全。ZEN具有较强的生殖毒性，可造成动物急慢性中毒，并通过食物链严重威胁人类身体健康。研发粮食与饲料中霉菌毒素的脱毒技术，对于改善动物生产性能、提高动物产品品质、保障食品安全有着重要意义[1-3]。

当前，对于霉菌毒素的脱毒方法有物理、化学及生物法。其中物理法包括原料稀释法、高温处理法等；化学法有碱处理、氧化处理等；生物法有酶降解法和微生物脱毒法。物理与化学法对霉菌毒素的降解效率较低且可能降低饲料营养价值，生物脱毒法可生成无毒或低毒降解产物，且多为专一性降解，不会破坏饲料中其他营养物质，是霉菌毒素脱毒的重要方法[4-5]。国内外关于霉菌毒素的生物降解已有诸多研究。Samuel 等[6]分离出一株假单胞菌（Pseudomonas），通过对其降解能力及降解产物的研究，发现该菌株在液体培养基中对0.2 μg/ml 的ZEN 降解率达到90%以上，且其降解产物无毒。Cho等[7]分离出一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其在液体培养基中对1 mg/kg ZEN的降解率高达99%，在固体培养基中对0.25 mg/kg ZEN 的降解率可达95%。Harkai 等[8]对124 株链霉菌（Streptomyces）降解AFB1和ZEN 的能力进行了研究，发现其中1 株链霉菌对AFB1降解率为88%，2 株链霉菌对ZEN降解率几乎可达100%。

现今已知的有效降解菌株多用于降解单一毒素，关于同时降解多种霉菌毒素的菌株鲜有报道。但实际上谷物中往往是多种霉菌毒素联合污染，其联合污染使得霉菌毒素间可能出现联合毒性作用，从而导致毒性更强[9-10]。因此，相比只降解单一毒素的菌株，筛选可同时降解多种霉菌毒素的菌株将具有更好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

采集自北京市郊的土壤、鸡肠道食糜、驴肠道食糜等多个来源的混合样本。

1.1.2 主要试剂和仪器

玉米赤霉烯酮与黄曲霉毒素B1、0.22 μm滤膜（Millipore）、细菌基因组DNA小量提取试剂盒（庄盟生物）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Tiangen）、革兰氏染液试剂盒（Aobox）、PCR仪T-100（Bio-Rad）、高效液相色谱RF-20A（Shimadeu），凝胶成像分析系统Universal HoodⅡ（Bio-Rad），高速冷冻离心机3K15（Sigma），电泳系统Powerpac（Bio-Rad），pH 计seven Compact（Meetlertoledo），恒温震荡培养箱HZQ-X100（苏州培英）。

1.1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，蒸馏水1 000 ml，调pH 值至7.0。121 ℃下蒸汽灭菌20 min。固体培养基中添加琼脂粉15 g。

1.2 菌株的富集、分离与筛选

称取2.5 g 样品放入装有25 ml PBS 溶液的三角瓶中，摇瓶后静置。取1 ml上清液，加入9 ml PBS，梯度稀释至1×10-7。每个梯度各取100 μl 涂布于LB 固体培养基上，同时设置3 个平行，置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h后分离单株并编号。

将分离所得菌株分别接种于5 ml LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养24 h，得到各菌株发酵液。取分离后不同菌株的发酵液各980 μl，分别加入20 μl ZEN 或AFB1储备液，使ZEN、AFB1终浓度分别为2、0.4 μg/ml，置于37 ℃、180 r/min 恒温摇床中振荡培养，反应72 h。同时以未接种且含有相同ZEN或AFB1浓度的LB培养基为对照。

1.3 菌株对ZEN与AFB1降解率测定

取待测样品，加入等体积甲醇，震荡混合后静置以充分浸提。于4 ℃、12 000 r/min条件下离心3 min，取其上清液过0.22 μm 滤膜，采用高效液相色谱（HPLC）检测。对照组做同样处理。

检测条件：采用Eclipse Plus C18 液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent）；检测AFB1时，流动相为45%甲醇+55%水（V/V），检测器的激发波长为360 nm，发射波长为440 nm；检测ZEN 时，流动相采用46%乙腈+46%水+8%甲醇（V/V），检测器的激发波长为274 nm，发射波长为440 nm；检测二者时，流速均为1.0 ml/min，进样量均为20 μl，柱温均为35 ℃。

采用下列公式计算ZEN和AFB1降解率：

所有数据均重复三次取平均值，并以“平均值±标准误差”绘图。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态学鉴定

采用平板划线法将降解菌接种于LB 固体培养基，37 ℃培养48 h后观察菌落形态；将分离纯化的菌株406进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察菌体形态，对菌株进行初步鉴定。

1.4.2 分子生物学鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒提取406菌株DNA，以此为模板扩增其16S rDNA序列。采用引物为通用引物，上游引物为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），下游引物为1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），50 μl反应体系中含有模板1 μl，引物27F和1492R（10 μmol/l）各2 μl，2×Premix-Taq 25 μl，ddH2O 20 μl。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变形30 s，53 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环后于72 ℃延伸10 min。通过1%(M/V)琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。利用凝胶成像分析系统Universal HoodⅡ检测电泳结果，采用无菌手术刀切割目标条带，通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段的回收，并送至上海生工生物工程技术有限公司测序。将测序结果提交至GenBank核酸序列数据库中，利用BLAST程序搜索同源序列，以Clustal X软件进行多重序列比对，再用MEGA 4.0软件构建系统发育树[11-12]。

1.5 菌株406中ZEN与AFB1降解物质的定位、定性

1.5.1 发酵液、上清液及菌悬液的制备

将菌株406 于LB 液体培养基中37 ℃、180 r/min培养24 h，得到发酵液。取发酵液10 ml 于4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min，上清液过0.22 μm滤膜，获得无细胞上清液，于4 ℃保存备用；下层菌体细胞用PBS 溶液重新悬浮，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，重复3次，冲洗3次后用PBS溶液重新悬浮至10 ml，振荡混匀，即为菌悬液。

1.5.2 降解ZEN或AFB1的物质来源定位

将上述所得的发酵液、上清液及菌悬液各980 μl，向其中分别加入20 μl霉菌毒素，使ZEN、AFB1终浓度分别为2、0.4 μg/ml。将反应体系置于37 ℃、180 r/min恒温摇床上孵育，以上试验均设置3 个重复，分别于12、24、36、48、72 h和96 h取样，用高效液相色谱检测各毒素残留量，以推测降解ZEN 与AFB1的活性物质位于发酵液、上清液还是菌悬液。

1.5.3 降解物质的定性

根据上述试验结果，取10 ml发酵上清液，分别给予以下处理：95 ℃水浴10 min 后冷却至室温；煮沸10 min后冷却至室温；加入0.1 g胰蛋白酶（即10 mg/ml胰蛋白酶）充分溶解并混匀；加入十二烷基硫酸钠0.5 g（即5% SDS）充分溶解并混匀。取处理后的样品分别与ZEN 或AFB1共培养，每个样品做3 个重复，于37 ℃、180 r/min 条件下进行降解试验，设置空白对照，72 h后用高效液相色谱检测各毒素残留量。

1.6 分离所得菌株对ZEN和AFB1的降解条件优化

1.6.1 温度对406降解菌降解效果影响

向980 μl 上清液中分别加入20 μl 霉菌毒素，使ZEN、AFB1终浓度分别为2、0.4 μg/ml；以pH值与上清液相同的LB 培养基为空白对照，分别在37、47、57、67 ℃和77 ℃的水浴锅中孵育，72 h 后取样，采用HPLC检测霉菌毒素残留量。

1.6.2 pH值对406降解菌降解效果影响

以5 mol/l NaOH 或5 mol/l HCl 分别调节上清液的初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，向980 μl调节pH值后的上清液中加入20 μl霉菌毒素，使ZEN、AFB1终浓度分别为2、0.4 μg/ml；以相同pH值的LB培养基为空白对照，置于37 ℃，180 r/min恒温摇床中孵育，72 h后取样，采用HPLC检测霉菌毒素的残留量。

2 结果

2.1 ZEN与AFB1降解菌的筛选鉴定

从多个不同来源的混合样本中经分离纯化获得279 株不同菌株，筛选后获得9 株可同时降解ZEN 和AFB1的菌株，其中菌株406对两种霉菌毒素的降解能力最强，其发酵液对ZEN 和AFB1的降解率分别为50%和54%，选择此菌株进行进一步研究。

图1 筛选所得的9株菌株对ZEN和AFB1的降解率

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态学鉴定

在LB 固体培养基上菌株的生长情况如图2a 所示，菌落呈淡黄色圆形，直径1 mm左右，中间隆起，表面湿润光滑有光泽，边缘整齐且成半透明状。通过革兰氏染色在光学显微镜下观察，菌体形态如图2b 所示，该菌株为革兰氏阳性菌，形态呈短杆状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或成八字排列。

2.2.2 分子生物学鉴定

经PCR 扩增后，菌株406 的16S rDNA 片段长度约为1 177 bp，在GenBank 的序列登录号/注册号为lcl|Query_166539，经过BLAST比对发现该菌株与谷氨酸棒状杆菌的同源性达到99%。使用Clustal X（版本号）与MEGA-X（版本号）构建系统发育树，结果如图3所示。结合形态学特征与BLAST比对，可以确定菌株406属于谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamate）。

图2 菌株形态图

2.3 谷氨酸棒状杆菌406降解ZEN与AFB1的活性物质定位

谷氨酸棒状杆菌406 中发酵液、上清液及菌悬液对ZEN 或AFB1的降解率随时间变化情况如图4、图5 所示。菌株406 的发酵液、上清液及菌悬液分别与ZEN 共培养96 h 后，对该毒素的降解率分别为54%、50%、13%（图4）。菌株406 的发酵液、上清液及菌悬液分别与AFB1共培养96 h 后，对该毒素的降解率分别为52%、58%、16%（图5）。由此可推断菌株406 降解ZEN 与AFB1的活性物质存在于上清液，表明菌株406 降解ZEN 和AFB1不是依赖菌体的吸附作用，而是由胞外的活性物质主导的生物降解作用。

图3 以16S rDNA序列为基础的降解菌406系统发育树

图4 谷氨酸棒状杆菌406菌液组分对ZEN降解率的影响

图5 谷氨酸棒状杆菌406菌液组分对AFB1降解率的影响

2.4 谷氨酸棒状杆菌406降解ZEN与AFB1的胞外物质定性

为了进一步判断谷氨酸棒状杆菌406 降解ZEN与AFB1的胞外物质的性质，给予菌株406上清液四种不同的处理，并考察处理后的上清液对ZEN 与AFB1的降解效果。经过高效液相色谱法检测发现（图6），经95 ℃水浴10 min 和煮沸10 min 处理的上清液对ZEN和AFB1的降解能力小幅提高；经5% SDS处理的上清液对ZEN 和AFB1的降解能力显著降低；经胰蛋白酶处理的上清液对ZEN和AFB1的降解能力影响不明显。热处理通常可以破坏DNA、维生素和大部分蛋白（酶）的空间结构，但菌株406上清液中的降解活性物质对热的耐受能力较强，较短时间热处理并未对其造成明显影响；SDS 作为变性剂，能破坏蛋白的空间结构，经5% SDS 处理，上清液对ZEN 和AFB1的降解能力显著降低，因此可以初步推断菌株406分泌的降解活性物质是蛋白类。

2.5 谷氨酸棒状杆菌406降解ZEN与AFB1的温度和pH值条件

2.5.1 pH值对谷氨酸棒状杆菌406降解效果的影响

如图所示（图7），谷氨酸棒状杆菌406的上清液在37～77 ℃之间对ZEN与AFB1均有较好降解效果，降解率均为40%以上；该菌株的最佳降解温度为67 ℃，此时其对ZEN与AFB1的降解率分别为89%、85%。

图6 热、SDS、胰蛋白酶处理对谷氨酸棒状杆菌406上清液降解ZEN和AFB1的影响

图7 温度对谷氨酸棒状杆菌406上清液降解ZEN和AFB1的影响

2.5.2 pH 值对谷氨酸棒状杆菌406 菌株降解毒素效果的影响(见图8)

图8 pH值对谷氨酸棒状杆菌406上清液降解率ZEN和AFB1的影响

由图8可知，该菌株上清液中的降解活性物质在pH 值5～9 范围内均可发挥降解作用，在pH 值7～8 时的降解效果最好，此时ZEN 与AFB1的降解率分别为51%、58%；随着pH 值升高或降低，降解率也逐渐降低，但是pH值升高对降解率的影响小于pH值降低对降解率的影响，由此可推测该菌适宜在中性或微碱性环境中生长。

3 讨论

霉菌毒素分布广、毒性强、物理化学方法去毒效果不理想已成为保障饲料安全的限制因素，因此筛选和发掘可高效降解霉菌毒素的微生物已成为当今研究热点。但是目前已报道的菌株多致力于降解单一毒素，在应对霉菌毒素联合污染时有一定局限性。本研究筛选出一株可同时降解ZEN和AFB1两种霉菌毒素的菌株406，经过16S rDNA鉴定确定为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamate），这是首次发现谷氨酸棒状杆菌可同时降解ZEN和AFB1。谷氨酸棒状杆菌已应用于微生物发酵领域，其可利用葡萄糖、乙酸等为唯一碳源，产生氨基酸、有机酸、维生素等[13]，也可用于降解有毒酚类芳香族化合物(阿魏酸、香草醛、苯酚、间苯二酚等)[14]。ZEN 中含有一个双酚基团，AFB1是一种多芳香族化合物，谷氨酸棒状杆菌406降解这两种毒素的方式很可能与降解酚类芳香族化合物的方式相似。

将毒素分别与发酵液、菌悬液、上清液共培养，发现上清液即胞外物质对ZEN和AFB1表现出较强的降解活性，且其降解能力强于菌悬液和发酵液。在Shu等[15]筛选到的维氏杆菌DY3108、Guan 等[17]筛选到的橙色黏球菌及Sangare 等[16]筛选到的铜绿假单胞菌N17-1中。谷氨酸棒状杆菌406对两种霉菌毒素的作用是由胞外活性物质发挥的降解作用，而不是基于细胞壁的吸附作用。

将谷氨酸棒状杆菌406 的上清液于95 ℃水浴10 min 或煮沸10 min 后，发现其对ZEN 和AFB1的降解能力有所提高，表明谷氨酸棒状杆菌406有较好的热稳定性，这使该菌株在实际生产中具有潜在的应用价值。在其他AFB1降解菌中也观察到了类似现象，Sangare 等[16]曾报道对铜绿假单胞菌N17-1 的无细胞上清液进行沸水浴10 min处理，在热活化作用的刺激下其对AFB1的降解活性提高了3.49%。Wang 等[18]发现煮沸10 min后镰刀菌WCQ3361的代谢产物仍保持99.4% AFB1降解活性。经SDS处理后，上清液对两种霉菌毒素的降解能力几乎完全被破坏，表明谷氨酸棒状杆菌406 的胞外物质对SDS 处理敏感，在橙色黏球菌ANSM068、维氏杆菌DY3108等其他黄曲霉毒素降解菌中也发现了类似结果[15，17]，Guan 等[17]推测有蛋白质或酶参与了AFB1的生物降解，并通过色谱法、离子交换柱层析等方法证实其降解活性组分为蛋白质。由此推测可能有蛋白类或酶类物质参与两种毒素的降解。但是经胰蛋白酶处理，谷氨酸棒状杆菌406的上清液对两种毒素的降解能力仅略有降低，这与上述推测的有蛋白类或酶类物质参与反应不符。Cuccioloni 等[19]的研究通过分析AFB1与胰蛋白酶之间相互作用的动力学和热力学参数，发现AFB1可与胰蛋白酶发生可逆结合，从而使胰蛋白酶催化反应的能力降低。初步推测由于AFB1与胰蛋白酶进行结合，导致胰蛋白酶催化反应能力降低，从而限制胰蛋白酶与菌株406上清液中活性物质作用，对其降解能力没有显著性影响。

通过对降解条件的优化确定谷氨酸棒状杆菌406的上清液对ZEN 与AFB1的最佳降解pH 值为8、最佳降解温度为67 ℃。酶促反应体系中，酶在最适pH值或最适温度下活性最高，菌株406的上清液在对ZEN和AFB1的降解中表现出这一特性，结合SDS 对上清液的处理结果，进一步推测降解活性物质为一种细菌所产胞外酶。此外，值得注意的是谷氨酸棒状杆菌406 对两种霉菌毒素在37 ℃仍具有50%以上的降解率，可用于实际生产中两种毒素污染饲料和粮食的生物脱毒。

4 结论

目前，有关于生物降解多种霉菌毒素的研究还很少，本研究筛选出的谷氨酸棒状杆菌406可同时降解ZEN 和AFB1两种霉菌毒素，为食品和饲料中两种毒素的生物降解提供了新的菌种资源。