不同处理豆粕及嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪肠道微生态系统的影响

■廖 珂 贺 琴 游金明* 方 华 杨 晋 罗波文 熊 昊

（1.江西农业大学 江西省动物营养重点实验室江西省优质安全畜禽生产产教融合重点创新中心，江西南昌330045；2.上海源耀生物股份有限公司，上海201316）

仔猪因早期断奶引起的应激，易引发肠道微生态系统平衡失调，从而导致肠道炎症及腹泻的发生，严重甚至导致死亡[1]。微生态系统是在一定空间结构内正常微生物群以其宿主的代谢产物、组织及细胞为环境，在长期进化过程中形成的物质、能量及基因能独立相互交换的统一生物系统[2]。肠道微生态系统有多种功能，其不仅起着维持肠道稳态，调节肠黏膜免疫的作用，还与炎症性肠病、过敏性疾病的发生发展密切相关[3]。微生态系统的稳定，对动物抵抗肠道病原菌引起的感染性疾病极其重要。研究表明，正常益生菌群犹如一道屏障，能阻止病原菌的入侵与生长，因此具有提高免疫力，对抗疾病，预防胃肠道感染的作用。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存。当胃肠道中有益菌群占优势时，能够提高动物抗病能力；当有害菌群占多数时，动物抵抗力下降，诱发疾病的产生[4-5]。动物采食的饲粮不但为动物提供所需的各种营养物质，同样也作为动物肠道内微生物的发酵底物，不同的饲粮组成会直接影响动物肠道微生物的组成结构[6]。董晓丽等[7]研究表明，添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌复合菌制剂可以显著降低仔猪粪便中大肠杆菌的数量，反映了其对肠道大肠杆菌的生长和繁殖具有抑制，从而维持肠道微生态平衡。刘辉等[8]研究发现，饲粮中添加益生菌能够有效改善生长猪的肠道微生态环境，增强机体免疫功能，提高饲粮养分表观消化率。豆粕是仔猪日粮中的大宗蛋白质饲料资源，对豆粕进行发酵或添加有益微生物不仅可以降低抗原蛋白的活性，而且可以改善仔猪肠道微生态环境。本研究旨在探讨不同处理加工的豆粕和嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪肠道微生态菌群结构的影响，研究结果将对大豆及其制品在仔猪日粮中的科学利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵豆粕、膨化大豆、嗜酸乳杆菌培养物由上海源耀生物股份有限公司提供，发酵豆粕、膨化大豆以及乳杆菌培养物的粗蛋白质含量分别为50%、35%和20%。

1.2 试验动物和分组设计

选用遗传背景、胎次和体重相近的21 日龄断奶仔猪240头，按随机区组设计分为5个组，分别为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组，每个试验组4个重复，每个重复12头仔猪，公母各半。

1.3 试验日粮和营养水平

在控制能量和粗蛋白质一致的前提下，用膨化大豆和嗜酸乳杆菌培养物来替代普通豆粕，以研究其对仔猪的影响。对照组仔猪饲喂玉米-豆粕型基础饲粮。试验Ⅰ组仔猪饲喂发酵豆粕代替10%普通豆粕的试验饲粮，试验Ⅱ组仔猪饲喂用膨化大豆代替对照组饲粮中豆粕的饲粮，试验Ⅲ组饲粮是在对照组基础上用嗜酸乳杆菌培养物代替3%原有原料，试验Ⅳ组饲粮是在对照组基础上用嗜酸乳杆菌培养物代替5%原有原料，饲粮配方参照NRC（2012）和我国猪饲养标准（2004）配制，饲粮组成和营养水平见表1。

1.4 饲养管理

试验仔猪在保育床上饲养，舍温控制在25～28 ℃，湿度控制在55%～65%。自由采食和饮水，粉料饲喂。正试期21 d，仔猪免疫按常规程序执行。试验第1、21 d清晨对仔猪进行空腹个体称重，其它日常管理按常规饲养管理方法进行。

1.5 样品采集与处理

在饲养至第21 d，每个重复选取1头接近平均体重仔猪进行屠宰，取空肠和盲肠中段两端双线结扎，锡箔纸包被，再用保鲜膜裹好液氮保存，用于微生物测定。

1.6 盲肠内容物菌群组成与比例

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取盲肠内容物菌群DNA。对DNA 样品进行检测，检测合格的样品构建文库：回收目的Amplicon 片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase 和T4 PNK 将打断形成的黏性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“A”，使得DNA 片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接；最后，用合格的文库进行cluster 制备和测序。

表1 饲粮组成与营养水平（风干基础）

1.7 肠道内容物细菌计数

称取空肠、盲肠内容物0.5 g 于无菌三角瓶。加入5 ml 经灭菌的生理盐水，振荡3～5 min 后，用移液枪准确吸取0.5 ml至盛有4.5 ml生理盐水事先灭菌的青霉素瓶中，用旋涡振荡器振荡1～2 min，制成1/10稀释液，依次进行102～106倍稀释。分别将空肠及盲肠内容物稀释液接种于相应的固体培养基上。每种指标检测5 个稀释梯度，每个梯度设3 个重复。大肠杆菌、沙门氏菌及总需氧菌于37 ℃有氧培养24 h 后进行菌落计数，产气荚膜梭菌、乳酸杆菌、双歧杆菌于37 ℃厌氧培养48 h后进行计数。

1.8 统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计。以重复为单位，以P＜0.05为显著性判断标准。各处理数据以“平均数±标准差”表示，并分析比较不同方式处理的豆粕以及嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪微生态系统的影响差异。

2 结果与分析

2.1 微生物群落门水平丰度分析（见图1）

由图1可知，对照组以及各试验组中肠道细菌共涉及12 个门，包含Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidete（拟杆菌门）、Euryarchaeot（广古菌门）、Fibrobactere（纤维杆菌门）、Firmicute（厚壁菌门）、Unclassifie（未分类细菌）、Proteobacteri（变形细菌门）、Spirochaete（螺旋菌门）、Tenericute（软壁菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）。其中，各试验组中细菌种类主要为Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Unclassifie（未分类细菌）和Proteobacteria（变形细菌门）。膨化大豆组仔猪肠道内纤维杆菌门含量显著高于对照组（P＜0.05），而对照组仔猪肠道内纤维杆菌门的含量几乎为零。3%嗜酸乳杆菌培养物组以及5%嗜酸乳杆菌培养物组有一定量的纤维杆菌门。与对照组相比，发酵豆粕组及膨化大豆组仔猪肠道内拟杆菌门丰富度有所增加，但无显著差异（P＞0.05）。嗜酸乳杆菌培养物组肠道中广古菌门数量显著高于对照组（P＜0.05），厚壁菌门数量虽有所增加，但无统计学差异（P＞0.05）；添加膨化大豆、嗜酸乳杆菌培养物均有降低试验期仔猪肠道放线菌门数量下降；添加发酵豆粕、嗜酸乳杆菌培养物均能使仔猪肠道内变形菌门以及螺旋菌门的数量下降。饲料中添加3%嗜酸乳杆菌培养物能使仔猪肠道中软壁菌门的数量减少。由此可知，饲粮中添加嗜酸乳杆菌培养物、发酵豆粕和膨化大豆均在一定程度上提高了断奶仔猪肠道内拟杆菌门、广古菌门、纤维杆菌门、厚壁菌门等有益菌的数量，降低了放线菌门、变形细菌门、螺旋菌门、软壁菌门等有害菌的含量。

图1 盲肠内容物菌群物种柱状图（门水平）

2.2 仔猪肠道微生物群落属水平丰度分析（见图2）

由图2可知，进一步细化分类水平到属（Genus），图中共显示丰度相对较高的24 个属种，各试验组的Lactobacillus（乳杆菌属）、Bacteroides（拟杆菌属）、Megasphaera（巨球型菌属）、Mitsuokella（光冈菌属）、Blautia（布劳特氏菌）、Coprococcus（粪球菌属）、Eubacterium（真杆菌属）数量均高于对照组，对照组的Actinobacillus（放线杆菌属）、Prevotella（普雷沃菌属）、Campylobacter（弧形杆菌）、Clostridium-IV（梭状芽孢杆菌四世）、Streptococcus（链球菌属）数量高于各试验组，且Lactobacillus（乳杆菌属）、Bacteroides（拟杆菌属）、Megasphaera（巨球型菌属）、Coprococcus（粪球菌属）、Eubacterium（真杆菌属）、Campylobacter（弧形杆菌）6种菌属的含量存在显著差异（P＜0.05）。3%嗜酸乳杆菌培养物、5%嗜酸乳杆菌培养物以及膨化大豆组的Collinsella（柯林斯菌属）数量显著高于对照组（P＜0.05）。

图2 盲肠内容物菌群物种柱状图（属水平）

2.3 Beta多样性分析（见图3）

由图3可知，3%嗜酸乳杆菌培养物组（试验Ⅲ组）和5%嗜酸乳杆菌培养物组试验（试验Ⅳ组）与对照组物种间的进化距离较远，枝长较长，三者的物种组成存在一定的差异性。发酵豆粕组（试验Ⅰ组）和膨化大豆组（试验Ⅱ组）与对照组样品也存在一定的距离。

图3 仔猪盲肠内容物菌落聚类分析图（weighted UniFrac）

2.4 盲肠内容物细菌计数

不同方式处理的豆粕及嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪空肠及盲肠菌群的影响见表2。从表2 可知，不同方式处理的豆粕及嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪空肠菌群（产气荚膜杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌）无显著影响（P＞0.05）。由盲肠细菌计数显示，3%嗜酸乳杆菌培养物、5%嗜酸乳杆菌培养物及膨化大豆组仔猪盲肠的乳酸菌数显著高于对照组（P＜0.05），但发酵豆粕组乳酸菌数与对照组差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比较，3%嗜酸乳杆菌培养物及5%嗜酸乳杆菌培养物使仔猪盲肠双歧杆菌数显著升高（P＜0.05）。各试验组与对照组的沙门氏菌、产气荚膜杆菌及大肠杆菌均数不存在显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

仔猪断奶后会出现胃肠道的生理紊乱，表现为食欲差、饲料利用率低、抗病力下降、腹泻等现象[9]。引起胃肠道功能紊乱不仅是胃肠道结构和生理的变化，而且还与肠道微生物密切相关[10]。肠道是动物机体内营养物质消化吸收的主要场所，同时也是机体最大的免疫器官。动物体内存在复杂的微生物群体，这些群体对宿主营养消化吸收、物质代谢及机体免疫等诸多方面起到重要作用[11]。

表2 不同方式处理的豆粕及嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪空肠及盲肠菌群的影响lg（cfu/g）

研究发现，微生物群体多样性增加通常与微生物区系的稳定性及抗病能力呈正相关[12]。在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门及变形菌门是动物肠道三种主要的细菌门类[13]。断奶仔猪肠道内优势菌群主要包括厚壁菌门中的乳杆菌属、巨球型菌属、粪球菌属等，而肠杆菌科的比例提高可能导致坏死性肠炎等病症[14]。李追[15]研究发现，肉仔鸡饲粮中添加嗜酸乳杆菌，回肠微生物区系中厚壁菌门相对丰富度增加，变形菌门丰富度降低。本研究结果表明，通过门水平聚类分析，厚壁菌门和拟杆菌门为断奶仔猪肠道中的优势菌群。与对照组相比，添加嗜酸乳杆菌组肠道厚壁菌门数量有所增加，变形菌门数量降低，而广古菌门数量显著升高。属水平上，乳杆菌属数量显著增加，弧形杆菌属降低。添加发酵豆粕拟杆菌门数量有所升高，粪球菌属数量显著上升、弧形杆菌属显著降低。由此可知，饲粮添加发酵豆粕、膨化大豆及嗜酸乳杆菌在一定程度上提高断奶仔猪肠道内有益菌群的数量，减少有害菌群的数量。而这些有益菌群不仅有利于维持盲肠微生物区系的稳定，一定程度上能改善肠道屏障功能[16]。

肠道菌群越丰富，分配越均匀，菌种之间相互依赖和制约性就越强[17]。暗示在应对应激状态时菌群缓冲能力越强，能更好地维持肠道微生态系统平衡，减少应激带来的危害[18]。

正常情况下，动物肠道内各菌群相互依存，共同维持肠道动态平衡，一旦肠道微生态平衡遭到破坏，有害菌就会大量繁殖，产生大量有害毒素，严重损害机体健康[19]。而仔猪断奶阶段，肠道内乳酸杆菌数量降低，大肠杆菌数量升高，肠道正常的微生态平衡被打破，易引发腹泻等症状[20]。大量研究表明，益生菌作为饲料添加剂能够改善断奶仔猪肠道微生态系统。谯仕彦等[21]发现，乳酸菌在改善猪肠道屏障功能方面具有很好的作用，这种作用与乳酸菌对肠绒毛结构、肠道菌群结构、黏液的分泌、上皮细胞通透性和免疫功能的调节有关。郝小燕等[22]研究表明，益生菌不仅能黏附于肠黏膜，而且能明显抑制致病菌黏附，从而提高肠道微生态的稳定性。研究也得到类似结果，通过盲肠细菌计数发现，饲粮添加嗜酸乳杆菌显著提高盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌数量，而膨化大豆组盲肠内乳酸杆菌数量显著升高，这可能是通过竞争肠道内结合位点，抑制有害菌在肠道内的附着，同时也可能通过分泌乳酸、乙酸、丙酸等降低肠腔内pH 值，从而抑制有害菌的黏附与繁殖，有益菌发展为优势菌群，促进微生态系统的平衡，加强肠道屏障功能。

4 小结

①饲粮添加发酵豆粕、膨化大豆嗜酸乳杆菌培养物均对断奶仔猪盲肠微生物区系产生了影响，添加嗜酸乳杆菌培养物增加乳杆菌属、拟杆菌属相对丰富度，降低弧杆菌属相对丰富度；添加膨化大豆及发酵豆粕增加拟杆菌属相对丰富度，降低弧杆菌属相对丰富度。

②饲粮添加发酵豆粕、膨化大豆及3%嗜酸乳杆菌培养物仔猪肠道菌群丰富度增加，抵抗应激能力相应增强，肠道微生态系统更加稳定,且相较之下3%嗜酸乳杆菌培养物组效果更佳。