结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态的临床意义探讨

袁航 屠世良

结直肠癌是常见、多发的恶性肿瘤之一。近年来，总发病率呈明显递增趋势。一项流行病学调查报告显示，结直肠癌发病率位居所有肿瘤的第5位，5年生存率较低[1]。因此，早期发现并给予个体化综合治疗具有重要意义[2]。microRNA（以下简称miRNA）是一类20～25个碱基的小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中。目前发现miRNA异常表达与肿瘤的发生、发展有着密切关系。关于miRNA的作用机制研究成为当前肿瘤发生机制研究的热点。与其他基因一样，肿瘤细胞中miRNA的表达受到包括DNA甲基化修饰在内的表观修饰等多种机制的调控，且在多种肿瘤中miRNA基因甲基化状态的改变与肿瘤临床表型及预后有关。由于不同组织来源的肿瘤存在特征性的miRNA表达谱，其甲基化状态也存在特异性[3]。目前关于结直肠癌中相关miRNA的CpG岛甲基化状态的研究仍较为少见。miR-34a是近年来发现的、具有抑癌基因样功能的重要调控因子[4]。有研究对结直肠癌组织中表达有差异的miRNA基因进行生物信息学分析，结果发现miR-34a的启动子区域或周围有CpG岛[5]。本研究对结直肠癌组织miR-34a启动子区CpG岛甲基化状态的临床意义作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2011年7月至2012年7月在本院行根治性切除术的48例结直肠癌患者为研究对象，收集其结直肠癌组织及癌旁5cm以上的正常黏膜组织。其中男28 例，女 20 例；年龄 29～75[62.5（54.3，72.0）]岁。所有患者术前未行放化疗；其病理诊断经2位病理科医生独立诊断明确，病理分期依据美国国立综合癌症网络指南公布的TNM分期标准。本研究经医院医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 结直肠癌组织及癌旁正常组织离体后尽快分块，每块150～200mg，液氮冷冻后置-80℃冰箱内备用。按照组织DNA抽提试剂盒说明书（北京天根生化公司）抽提结直肠组织基因组DNA，并测定浓度。

1.2.2 miR34-a启动子区甲基化检测 采用甲基化特异性PCR（MSP）法。通过在线Meth-Primer软件（http://www.urogene.org/methprimer/）设计甲基化、非甲基化序列的引物（其信息见表1[5]），以亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板进行PCR扩增：95℃预变性10min，94℃15s，共40个循环；55℃ 30s，72℃ 40s，再 72℃延伸 10min。非甲基化扩增体系的退火温度提高至56℃，其他步骤相同。扩增产物为2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外光照射显带。RT-PCR：取1～2μl甲基化修饰型DNA进行PCR，扩增产物为2.5%琼脂糖凝胶电泳，然后紫外光照射显带，确定与引物互补的DNA序列甲基化状态。对PCR产物进行电泳，并根据电泳条带情况进行判定：（1）甲基化特异性引物扩增出目的条带，而非甲基化特异性引物未扩增出条带，为甲基化；（2）非甲基化特异性引物扩增出目的条带，而甲基化引物未扩增出条带，为非甲基化；（2）对引物均能扩增出目的条带的半甲基化，判断为甲基化。

1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用log-rank法比较不同miR-34a启动子区甲基化状态的结直肠癌患者总生存率、无病生存率。结直肠癌预后危险因素的分析采用Cox比例风险回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 miR-34a甲基化引物信息

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常组织中miR34-a启动子区甲基化率比较 结直肠癌组织与癌旁正常组织中miR34-a启动子区甲基化率分别为47.9%（23/48）、43.8%（21/48），差异无统计学意义（P＞0.05），检测所得电泳图见图1。

图1 结直肠癌组织与癌旁正常组织中miR34-a启动子区甲基化状态检测电泳图（M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态与患者临床特征的关系 结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤最大直径、远处转移等无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与淋巴结转移、TNM分期等有关，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

2.3 结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化与患者预后的关系 本组患者随访时间15～100[52（42，79）]个月。23例结直肠癌组织甲基化患者1、3、5年生存率分别为100.0%、69.6%和 34.8%，25例非甲基化患者 1、3、5年生存率分别为100.00%、88.0%和72.0%。甲基化患者总生存率、无病生存率均低于非甲基化患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 2-3。

2.4 结直肠癌预后危险因素分析 经单因素分析发现，肿瘤TNM分期、淋巴结转移、远处转移、miR-34a启动子区甲基化状态与患者预后有关，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；性别、年龄、肿瘤最大直径、病理组织学类型、分化程度、浸润深度与预后均无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。将上述单因素分析结果P＜0.05的因素纳入Cox比例风险回归模型分析，结果显示远处转移是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），miR-34a启动子区甲基化状态不是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素（P＞0.05），见表3。

表2 结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态与患者临床特征的关系[例（%）]

表3 结直肠癌预后危险因素的Cox比例风险回归模型分析

3 讨论

miRNA主要通过促进靶mRNA的降解或抑制其翻译过程来发挥调控作用，广泛参与细胞增殖、凋亡、代谢及分化等过程。Monzo等[6]首次研究表明，结直肠癌及腺瘤性息肉组织中miR-143、miR-145表达明显下调，并提出结直肠癌组织中存在特异性miRNA表达谱。随后，结直肠癌组织特异性miRNA表达谱的测定以及其与患者临床特征的关系成为研究热点。miR-34a位于人染色体1p36.23，该位点多伴随着多个基因的缺失或突变，与肿瘤的发生密切相关。在乳腺癌、肺癌组织中，miR-34a表达常下降或缺失；但关于其在结直肠癌组织中的表达情况，各研究结果尚不统一[4，7-9]。最近研究发现，miR-34a在其启动子区具有p53蛋白结合位点，是p53直接下游靶基因，受p53激活转录，通过调控细胞周期相关蛋白（cyclinE2、cdk6等）的表达，使细胞周期阻滞于G1期，或通过抑制下游BCL-2靶基因来诱导细胞的凋亡[10]。Hiroshi等[9]在大肠癌细胞系HCT116和RKO中，观察到miR-34a有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

图2 结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化与非甲基化患者总生存率的曲线

图3 结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化与非甲基化患者无病生存率的曲线

甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一。DNA甲基化在调控细胞正常发育、基因表达模式及基因组的稳定性中起着重要作用。DNA甲基化主要发生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。这些常在基因上游调控区的启动子区高度聚集的CpG二核苷酸，称为CpG岛。在人类许多肿瘤中，都能发现不同程度的CpG岛异常甲基化现象，表现为基因组整体甲基化下调，抑癌基因调控区域甲基化上调[11]。本研究检测结果发现，部分患者结直肠癌组织miR-34a甲基化较高，但与癌旁正常组织比较差异无统计学意义，可能与本研究样本量较小有关。进一步研究发现，结直肠癌组织中miR-34a基因CpG岛甲基化状态与肿瘤TNM分期、淋巴结转移等有关，与患者预后无关。甲基化状态与预后呈相关性，提示甲基化状态的改变可能参与肿瘤增殖转移过程，并影响预后。DNA甲基化修饰可能调控肿瘤细胞中相关miRNA的表达。Satio等[12]较早发现DNA甲基化可能会影响miRNA的表达，同时指出DNA甲基化和组蛋白修饰调控miR-127的表达，且甲基化与组蛋白修饰间存在一定的协同作用；miRNA不仅参与表观遗传的调控（DNA甲基化），还受到DNA甲基化等表观遗传影响。有研究报道miR-34a在宫颈癌、食管癌、肝癌等多种肿瘤组织中呈CpG岛高甲基化状态，且高甲基化所致的表达沉默或下调可能导致下游靶标增殖或凋亡相关癌蛋白高表达，从而促进肿瘤的发生、发展[5，13-16]。有研究在结直肠癌中也发现了一些相关miRNA存在甲基化调节机制[17]。某研究表明，结直肠癌中miR-34a低表达者，其启动子区甲基化水平较高，两者呈负相关[18]。本研究Cox比例风险回归模型分析结果显示，仅远处转移是预后的独立预测因子，miR-34a启动子区CpG岛甲基化状态尚不能作为独立预测因子；这可能与样本量较小有关，也可能是miR-34a与下游靶分子形成交叉网络作用，而非独立作用。以上猜想仍需后续机制研究进一步验证。

综上所述，miR-34a启动子区甲基化状态与结直肠癌患者淋巴结转移、TNM分期及预后有关，可能参与肿瘤进展转移过程的调控。