雌激素对人肝癌HepG2细胞脂肪变性的作用及AQP7表达的影响

傅晓华 朱晶 舒静

非酒精性脂肪肝是一种与胰岛素抵抗、遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，不仅可以导致肝病性残疾和死亡，也是2型糖尿病、心血管疾病的危险因素[1-2]。肝脏脂肪的合成和分泌增加，脂肪氧化和排出减少，可导致肝脏脂肪堆积过多[3]。研究表明，绝经后女性非酒精性脂肪肝患病率明显高于绝经前女性，提示雌激素在非酒精性脂肪肝的发生、发展中可能具有一定的作用[4-5]。目前关于低水平雌激素导致脂肪肝的机制尚未清楚。有学者认为，肝脏脂质代谢失调是非酒精性脂肪肝发展的先决条件[6]。TG是甘油和游离脂肪酸反应的产物，是肝脂质的主要形式。肝内TG的合成与分泌发生不平衡，可导致TG在肝细胞中累积，这是脂肪肝的主要特征[7]。水通道蛋白7（AQP7）是一种水-甘油转运蛋白，与成人肥胖症关系密切[8]。在脂肪细胞中，AQP7缺乏会增加甘油激酶活性，增强TG合成，最终导致肥胖[9]。本研究拟探讨雌激素对人肝癌HepG2细胞脂肪变性的作用及AQP7表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器 HepG2细胞（中国科学院上海分院细胞库）、FBS（批号 56987，中国碧云天公司）、Dulbecco改良Eagle培养基（批号632547，美国 GE Healthcare Life Sciences公司），青霉素、链霉素、谷氨酰胺（批号4789、21047、54784，美国 Sigma公司），油酸（批号14596，中国碧云天公司），雌激素（批号XS5874，美国赛默飞世公司），噻唑蓝（MTT，批号15487，美国赛默飞世公司），结晶紫（批号45642132，碧云天科技公司），油红O溶液（批号20149，美国 Sigma-aldrich公司），苏木素（批号 BG7895，美国Sigma Aldrich公司），混合-R型（Hybrid-R）试剂盒（批号 QA14789，韩国 Gene All公司），蛋白酶抑制剂混合物（批号154789，德国Roche Diagnostics公司），AQP7一抗（批号 21569，1∶3 000，美国Danvers公司），β-肌动蛋白（批号20165，美国Santa Cruz Biotechnology公司），电化学发光（ECL）溶液（批号6547，美国EMD Millipore Corporation公司）。Bio-Rad 680型酶标仪（美国Bio-Rad公司），贝克曼AU-480全自动生化仪（美国贝克曼公司），LeGene VF789 cDNA合成系统（美国LeGene Bioscience公司），Step One软件（美国Life Technologies公司），Davinch ChemiTM化学发光成像系统（韩国Davinch-K公司）。

1.2 细胞培养 将HepG2细胞置于Dulbecco改良Eagle培养基（含 10%FBS、100mg/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mmol谷氨酰胺），在37℃、含混合气体（95%O2+5%CO2）的潮湿环境中培养。随后用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 细胞分组与处理 将HepG2细胞分为4组，各组每孔设6个平行样，培养72h。（1）HepG2细胞组：取10ml HepG2细胞液（细胞浓度为5×106/ml）放入含10%FBS的DMEM培养液中，置于37℃、含混合气体（5%CO2+2%O2+93%N2）的培养箱中培养。（2）脂肪变模型组：DMEM培养液中加入200μl浓度为2.0mM的油酸溶液，其余同（1）。（3）雌激素低剂量组：再加入 500μl浓度为 40.0μg/ml的雌激素，其余同（2）。（4）雌激素高剂量组：再加入500μl浓度为80.0μg/ml的雌激素，其余同（2）。

1.4 细胞存活率测定 采用MTT法。将各组培养结束的HepG2细胞按1.5×103个/孔的密度接种于96孔板中，孵育48h。然后加入100μl MTT溶液处理2h。4h后抽吸除去MTT溶液，将结晶紫溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。使用Bio-Rad 680型酶标仪在570nm处读取吸光度（OD）。细胞存活率=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）。

1.5 细胞脂滴面积比测定 采用油红O溶液染色法。细胞用PBS洗涤3次，10%甲醛溶液固定1h，用蒸馏水洗涤3次，60%异丙醇洗涤2次，60%过滤的油红O溶液（0.7g/200ml异丙醇）在室温下孵育30min。再用水洗涤1次，苏木精染色，加入异丙醇后室温下振荡5min。使用Bio-Rad 680型酶标仪在510nm处读取OD，并计算HepG2细胞脂滴面积比。脂滴面积比=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）。

1.6 TG水平检测 收集HepG2细胞上清液，使用贝克曼AU-480全自动生化仪测定HepG2细胞TG水平。采用尼罗红染色法，观察各组HepG2细胞内脂滴颗粒堆积情况。

1.7 AQP7 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。使用Hybrid-R试剂盒从HepG2细胞中分离总RNA。再用LeGene第一链cDNA合成系统将cDNA与1μg总RNA杂交。使用RT-PCR仪测定AQP7mRNA相对表达量。使用Step One软件测定样品的2-ΔΔCt值。设GAPDH为内源对照。GAPDH基因的正向引物序列：5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′，反向引物序列：5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′；AQP7基因的正向引物序列：5′-GACGACCTCAACGCACAGTA-3′，反向引物序列：5′-AGGAGTCCCATGATGAGATTGT-3′。

1.8 AQP7蛋白表达检测 采用Western blot法。洗涤细胞并用PBS刮擦，在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液中温育。在12%十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶中分离相同量的总蛋白质（20μg）并转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。使用AQP7一抗孵育，随后将膜与第二抗体（1∶10 000稀释）一同温育，β-肌动蛋白作为内参。使用DavinchChemi TM化学发光成像系统、ECL溶液检测蛋白印迹。

1.9 统计学处理 应用SPSS 23.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组HepG2细胞存活率比较 HepG2细胞组、脂肪变模型组、雌激素低剂量组、雌激素高剂量组细胞存活率分别为（99.12±0.03）%、（22.63±9.65）%、（48.69±8.63）%、（61.63±9.69）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较发现，与HepG2细胞组比较，脂肪变模型组细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与脂肪变模型组比较，雌激素低、高剂量组细胞存活率均明显升高（P＜0.05）；雌激素高剂量组细胞存活率明显高于雌激素低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 4组HepG2细胞脂滴面积比比较 HepG2细胞组、脂肪变模型组、雌激素低剂量组、雌激素高剂量组脂滴面积比分别为（2.65±0.69）%、（12.65±1.21）%、（7.54±1.63）%、（3.69±1.65）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较发现，与HepG2细胞组比较，脂肪变模型组脂滴面积比升高（P＜0.05）；与脂肪变模型组比较，雌激素低、高剂量组脂滴面积比均明显降低（均P＜0.05）；雌激素高剂量组脂滴面积比明显低于雌激素低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 4组HepG2细胞脂滴面积比较（a：HepG2细胞组；b：脂肪变模型组；c：雌激素低剂量组；d：雌激素高剂量组；苏木素染色法，×200）

2.3 4组HepG2细胞TG水平比较 HepG2细胞组、脂肪变模型组、雌激素低剂量组、雌激素高剂量组TG水平分别为（0.87±0.33）、（5.99±0.32）、（3.32±0.32）、（1.34±0.32）mmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较发现，与HepG2细胞组比较，脂肪变模型组TG水平明显升高（P＜0.05）；与脂肪变模型组比较，雌激素低、高剂量组TG水平均明显降低（均P＜0.05）；雌激素高剂量组TG水平明显低于雌激素低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组HepG2细胞内脂滴颗粒堆积情况，见图2（插页）。

图2 4组HepG2细胞内脂滴颗粒堆积情况比较（a：HepG2细胞组；b：脂肪变模型组；c：雌激素低剂量组；d：雌激素高剂量组；尼罗红染色法，×200）

2.4 4组HepG2细胞AQP7 mRNA及蛋白表达比较 4组HepG2细胞AQP7 mRNA及蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较发现，与HepG2细胞组比较，脂肪变模型组AQP7 mRNA及蛋白相对表达量均明显降低（均P＜0.05）；与脂肪变模型组比较，雌激素低、高剂量组AQP7 mRNA及蛋白相对表达量均明显升高（均P＜0.05）；雌激素高剂量组AQP7 mRNA及蛋白相对表达量均明显高于雌激素低剂量组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。4组HepG2细胞AQP7蛋白表达的电泳图，见图3。

2.5 HepG2细胞AQP7 mRNA及蛋白表达与脂滴面积比、TG水平的相关性 4组HepG2细胞AQP7 mRNA及蛋白相对表达量与脂滴面积比、TG水平均呈负相关（均P＜0.05），见表 2。

表1 4组HepG2细胞AQP7mRNA及蛋白表达比较

图3 4组HepG2细胞AQP7蛋白表达的电泳图（a：HepG2细胞组；b：脂肪变模型组；c：雌激素低剂量组；d：雌激素高剂量组）

表2 HepG2细胞AQP7 mRNA及蛋白表达与脂滴面积比、TG水平的相关性（r值）

3 讨论

绝经是女性生命周期中发生的自然过程。绝经期间发生的卵巢分泌雌激素减少，被认为是骨质疏松症、卒中、肝脏疾病等多种疾病的主要原因。女性绝经状况与非酒精性脂肪肝风险升高有关，但其潜在的分子机制仍未清楚。有实验建立大鼠卵巢切除术（OVX）模型来评估雌激素耗竭对肝脂肪变性的影响，结果发现绝经相关的雌激素减少与骨丢失风险增加、内脏肥胖、肝脏脂肪变性等相关[10]。然而，在雌激素拮抗剂处理小鼠的肝脏标本中可观察到脂肪变性，同时脂肪生成基因乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、甘油二酯酰基转移酶等表达上调；但雌激素补充可减轻OVX诱导的肝脂肪变性，降低脂肪生成基因的表达水平[11]。本实验从细胞水平探讨了雌激素对HepG2细胞脂肪变性的影响。结果显示，与HepG2细胞组比较，脂肪变模型组细胞存活率降低，脂滴面积比、TG水平均升高；与脂肪变模型组比较，雌激素低、高剂量组细胞存活率升高，脂滴面积比、TG水平均降低；与雌激素低剂量组比较，雌激素高剂量组细胞存活率升高，脂滴面积比、TG水平均降低。同时还发现，雌激素能抑制油酸诱导HepG2细胞脂肪变性的程度。

相关研究表明，雌激素通过细胞内激素特异性雌激素受体的信号来调节人体生理学[12-14]。在AQP中检测到的功能性雌激素反应元件，包括AQP5、AQP2、AQP7[15-16]。研究表明，AQP7能调节脂肪细胞甘油渗透性，从而控制TG积累和脂肪细胞大小[17-18]。本研究假设AQP7可能作为雌激素的靶基因，并在油酸诱导的肝脏脂肪变性中发挥作用。结果表明，油酸处理能下调肝脏中AQP7的表达，提示AQP7参与低雌激素诱导的脂质积累。为进一步研究AQP7在雌激素耗竭诱导脂质积累过程中的功能，笔者分析了高、低剂量雌激素对HepG2细胞AQP7 mRNA及蛋白表达的影响；结果显示，与HepG2细胞组比较，脂肪变模型组AQP7 mRNA及蛋白相对表达量均降低；与脂肪变模型组比较，雌激素低、高剂量组AQP7 mRNA及蛋白相对表达量均升高；与雌激素低剂量组比较，雌激素高剂量组AQP7 mRNA及蛋白相对表达量均升高。以上结果表明雌激素能通过上调AQP7表达来减少脂肪生成。

综上所述，雌激素能抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪变性，其机制可能与雌激素能上调AQP7表达有关。但本研究仅为单纯的体外细胞实验，雌激素诱导AQP7转录调控的机制需要进一步研究证实。