经相同肝实质细胞体积分摊的血清HBsAg水平与肝组织病理进展相关而与HBeAg状态无关

谭 雷，吴 涛，吕 艳，王韦力，任 杰，郑荣琴，吴泽倩

（中山大学附属第三医院1.超声科，2.感染科，广东 广州 510630）

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者血清中检测到的亚病毒颗粒的数量远远超过具有感染性的完整成熟病毒颗粒，有效抗病毒治疗可以很好地抑制外周血HBV DNA，而乙型肝炎表面抗原（hepatitisb serum antigen，HBsAg）仍可持续合成分泌。目前HBsAg在慢乙肝自然病程中的动力学变化特点及在发病机制方面的作用等尚未完全明确［1-2］。近年来，血清HBsAg含量变化在CHB的病情监测和抗病毒治疗疗效预判等方面取得了较大进展。无论HBeAg阳性或是HBeAg阴性的CHB，反复的肝细胞炎症活动，往往伴随着肝细胞的坏死和肝组织纤维化的累积，进而影响肝实质细胞的总体积（hepatic parenchyma cell volume，HPCV），也就是肝实质细胞数量［3］。HBeAg阴性阶段往往处于CHB自然病程靠后的阶段，病程的进展及e抗原状态对HBsAg的影响究竟是如何呢？当肝脏提供给HBV复制的场所——肝细胞的数量不断减少时，是否会影响合成并分泌至外周血的HBsAg数量呢？因此，有必要探讨扣除不同肝纤维化程度对HBV复制的场所——肝实质细胞数量的影响后，HBsAg的动态变化情况。这将有助于进一步阐明CHB的发病机制，监测病情进展，为优化抗病毒治疗策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

自2015年7月至2017年10月于中山大学附属第三医院因病情需要而进行了肝穿刺活检及HBsAg定量检测的CHB患者168例，其中HBeAg阳性66例，HBeAg阴性102例。HBeAg阳性CHB患者中男性46例，女性20例，年龄（35±9）岁；HBeAg阴性CHB患者中男性81例，女性21例，年龄（40±9）岁。慢性乙型病毒性肝炎的诊断标准符合 2017年 EASL《慢性乙型肝炎管理指南》［4］。所有的患者均未应用过核苷（酸）类似物、干扰素和胸腺素等抗病毒药物，无合并其他肝炎病毒感染，排除抗病毒治疗及其他嗜肝病毒对肝组织纤维化程度及血清HBsAg水平的可能影响。

1.2 伦理声明

本研究为临床回顾性研究。168例CHB患者因其当时病情需要而进行了肝穿刺活检及HBsAg定量、乙肝两对半等检测。所有患者检查前均按照临床操作规范被充分告知肝穿刺活检目的及可能风险，并签署知情同意书。168例患者相关的数据资料已充分匿名。

1.3 乙肝两对半及血清HBsAg的检测

采用罗氏ECL仪器及配套试剂以电化学发光法检测乙肝两对半及血清HBsAg定量。检测结果按照以下指标作为判别标准：HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe和Anti-HBc参考值范围分别为＜1.0（cut off index，COI）、0～10 U/L、＜1.0 COI、＞1.0 COI和＞1.0 COI。检测结果的COI值在参考值范围以内为阴性，参考值范围以外为阳性。HBsAg定量检测范围：0.5～130 U/mL，稀释后20～52 000 U/mL。

1.4 肝组织病理诊断及显微镜视野下纤维化面积的测定

使用Esaote Au4型彩色多普勒机（美国）做引导，使用其配套的16G活检枪对168例CHB患者的肝组织进行肝活检，均切割大约20 mm长度肝组织以Bouin′s液固定和石蜡包埋，接着分别用苏木素-伊红（HE）染色和Masson法网状纤维染色。由我院病理科医师根据Desmet VJ慢性肝炎的分类进行肝组织炎症分级和肝纤维化分期［5-6］。

1.5 从肝纤维化面积到肝实质细胞体积的推算

肝脏主要由大量肝小叶构成，而肝小叶主要由大量的肝实质细胞、少量的内皮细胞、成纤维细胞、库普弗细胞和肝星状细胞等组成，肝实质细胞体积大小即可代表肝细胞数量的多少。

根据我们原先全自动图像分析研究，肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肝纤维化面积的百分比分别为8.31%±2.90%、11.43%±2.76%、14.97%±5.88%和20.73%±4.44%；相对应地，用检测视野图像面积减去肝纤维化面积的百分比就可得到肝实质细胞面积的百分比，分别为91.69%，88.57%，85.03%和 79.27%［7］。

再根据组织病理学切片和显微镜的圆形视野原理，肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期视野的100%圆形面积基本上分别由肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝实质细胞面积加上肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝组织纤维化面积组成。由此可以推理，肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期视野的100%圆形面积分别=小圆形肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝实质细胞面积+包绕小圆形的半月形肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝纤维化面积。

那么，肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝实质细胞面积分别=肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期视野的100%圆形面积-肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝纤维化面积。又根据数学圆形面积公式（A）=圆周率（π）×半径平方（R2），即：A=πR2；得到肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期肝实质细胞小圆形的半径（R）分别=开方根（ ）小圆形面积（A）除以（/）圆周率（π），即：R= A/π。由此，求出肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝实质细胞圆形面积的半径分别为 91.69%/3.14=0.5404、 88.57%/3.14=0.5311、 85.03%/3.14=0.5204和 79.27%/3.14=0.5023。

通过视野的立体旋转360度，再根据球体的体积计算公式，球体体积（V）=4/3圆周率（π）×半径立方（R3），即：V=4/3πR3，推出肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期的肝实质细胞体积的百分比分别=4/3π×肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期肝实质细胞小圆形半径的立方（R3），得到其值分别为66.07%、62.72%、59.00%和53.06%。相应地，肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期肝纤维化的体积分别为100%-66.07%=33.93%、100%-62.72%=37.28%、100%-59.00%=41.00%和100%-53.06%=46.94%。推理和计算过程见图1。

1.6 经相同肝实质细胞体分摊后的血清HBsAg定量

用某一肝纤维化分期时，其检测到的血清HBsAg定量水平除以其所对应时的肝实质细胞体积（肝细胞数量），即可得到其经相同肝实质细胞体积（肝细胞数量）平摊计算后的血清HBsAg定量水平。

1.7 统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。先对血清HBsAg水平进行对数转换后再统计分析，计量资料以x±s表示。HBeAg阳性与HBeAg阴性CHB的血清HBsAg定量水平，以及经相同HPCV分摊计算后的血清HBsAg定量水平之间的比较用t检验，P＜0.05认为有统计学意义。肝组织炎症分级、纤维化分期与血清HBsAg定量水平，以及与经相同HPCV分摊计算后的血清HBsAg定量水平的相关性分析使用Spearman等级相关分析，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎肝组织炎症分级和纤维化分期

无论HBeAg阳性或阴性CHB，其肝组织炎症分级与肝组织纤维化分期的病理分级均呈正相关性（P＜0.001）。较严重的肝组织炎症分级常伴有较严重的肝组织纤维化分期（表1）。

2.2 血清HBsAg及经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg在HBeAg阳性和阴性慢乙肝之间的比较

HBeAg阳性CHB的血清HBsAg水平较HBeAg阴性者高，两者之间的差异具有统计学意义（t=2.235，P=0.028）。而扣除CHB病程不同阶段累积产生的肝纤维化成分对HPCV的影响后，即经相同肝细胞数量分摊后的血清HBsAg水平在HBeAg阳性与HBeAg阴性之间差异无统计学意义（t=1.812，P=0.073，表2）

图1 肝组织纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期时各自肝实质细胞面积和肝实质细胞体积的推算示意图Fig.1 Sketch map of calculation of hepatic parenchyma cell volume in hepatic fibrosis stagesⅠ-Ⅳduring the natural history of CHB

2.3 血清HBsAg及经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg分别与肝组织炎症分级和纤维化分期的相关性分析

无论HBeAg阳性或阴性，在CHB病程缓慢进展过程中，其血清HBsAg定量水平的高低与肝组织炎症程度均无相关性（HBeAg阳性：rs=0.020，P=0.876；HBeAg阴性：rs=0.037，P=0.711）。扣除病程不同阶段累积产生的肝纤维化成分对HPCV的影响后，即经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg定量水平与肝组织炎症均呈正相关性（HBeAg阳性：rs=0.309，P=0.012；HBeAg阴性：rs=0.389，P＜ 0.001）。

表1 HBeAg阳性和HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的肝组织炎症分级和纤维化分期Table 1 Distribution of liver inflammation grades and hepatic fibrosis stages in HBeAg-positive and HBeAgnegative chronic hepatitis B patients

无论HBeAg阳性或阴性，在CHB病程缓慢进展过程中，其血清HBsAg定量水平的高低与肝纤维化程度均无相关性（HBeAg阳性：rs=0.087，P=0.488；HBeAg阴性：rs=0.144，P=0.148）。扣除病程不同阶段累积产生的肝纤维化成分对HPCV的影响后，即经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg定量水平与肝纤维化程度均呈正相关性（HBeAg阳性：rs=0.490，P＜0.001；HBeAg阴性：rs=0.599，P＜ 0.001；图2、3）

3 讨论

从CHB自然病程的病理改变来看，血清HB-sAg的动态变化与肝组织炎症及纤维化关系的研究较多，但结果不一［8-13］。然而，以上结论均未考虑到肝组织纤维化累积对肝脏体积及肝实质细胞数量的影响。无论HBeAg阳性或阴性感染阶段，其肝组织损害的病理标志一致包括肝组织炎症活动和纤维化形成。病理下肝组织炎症的进展常常伴随着纤维结缔组织的累积，从而影响肝实质细胞体积，即减少了有效肝细胞数量，而这一因素足以影响总体肝实质细胞合成释放至外周血中的HBV DNA 和HBsAg含量［14-16］。

表2 血清HBsAg及经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg在HBeAg阳性和阴性慢乙肝之间的比较Table 2 Statistical analysis of serum HBsAg and HBsAg normalized by the same HPCV in HBeAg-positive and HBeAg-negative CHB（，lgU/mL）

表2 血清HBsAg及经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg在HBeAg阳性和阴性慢乙肝之间的比较Table 2 Statistical analysis of serum HBsAg and HBsAg normalized by the same HPCV in HBeAg-positive and HBeAg-negative CHB（，lgU/mL）

t P Serum HBsAg Serum HBsAg normalized by the same HPCV HBeAg-positive CHB 3.61±0.53 6.01±1.02 HBeAg-negative CHB 3.44±0.37 5.74±0.80 2.235 1.812 0.028 0.073

图2 血清HBsAg及经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg与肝组织炎症分级的相关性分析Fig.2 Spearman correlations of serum HBsAg/HBsAg normalized by the same HPCV with liver inflammation grades

图3 血清HBsAg及经相同肝细胞数量分摊计算后的血清HBsAg与肝组织纤维化分期的相关性分析Fig.3 Spearman correlations of serum HBsAg/HBsAg normalized by the same HPCV with hepatic fibrosis stage

在本研究中，HBeAg阳性患者的血清HBsAg高于HBeAg阴性患者。而扣除HBV感染自然病程中不同阶段累积产生的肝纤维化成分对肝实质细胞体积（肝细胞数量）的影响后，即经相同肝细胞数量平摊计算后的血清HBsAg水平在HBeAg阳性与HBeAg阴性HBV感染阶段无差异。以上提示，CHB自然病程中HBeAg消失或HBsAg的下降并不能完全代表HBV复制程度的下降或肝脏炎症静熄。部分患者出现HBeAg消失多由于病毒基因前C区或C区启动子区域变异而不能产生HBeAg［17-18］。HBeAg阴性HBV感染阶段，其单个肝细胞内HBV的活跃复制与表达并不亚于HBeAg阳性感染阶段，提示无论HBeAg阳性或阴性CHB，单个肝细胞内病毒复制时通过免疫介导的病理损伤机制及程度相仿。

另本研究显示，无论HBeAg阳性或HBeAg阴性CHB，在扣除不同肝纤维化分期对HPCV的影响后，即经相同肝细胞数量平摊计算后的血清HBsAg水平与肝组织炎症和纤维化程度有正相关性。本研究结果提示，随着慢性HBV感染的自然病程由HBeAg阳性至HBeAg阴性的转换过程中，我们可检测到的外周血HBsAg水平的“自然下降”并不代表着病毒复制的静止或病情的稳定甚至好转，反而单个肝细胞内HBV的复制较前更加活跃，实质上加重了病毒复制时通过免疫介导的病理损伤，更易隐匿进展至肝硬化甚至肝恶性肿瘤［19-21］。提示临床上对这部分HBeAg阴性、HBsAg低水平的“病情相对稳定”的感染者，应充分考虑到其可能隐匿进展的纤维化成分对HPCV，即肝实质细胞数量的影响，需高度谨慎这些人群可能正在隐匿地进展为肝硬化甚至发展为肝恶性肿瘤。对于这些肝功能正常的、低HBsAg滴度的HBeAg阴性慢性HBV感染者，仍强烈推荐行无创肝纤维化评估或肝组织活检，切勿错过抗病毒治疗的最佳时机［22-23］。