EB病毒对胃癌细胞增殖、凋亡和脂代谢的影响

闭原桦，陈健宁，黄君庭，龚丽萍，邵春奎

（中山大学附属第三医院病理科，广东广州 510630）

胃癌是我国最常见的肿瘤之一，发病率仅次于肺癌［1］。EB病毒相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC）是胃癌四种分子分型之一，与EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）密切相关，约占胃癌患病人数的10%，每年新发近8万病例［2］，而且每年全世界癌症患者中有1.8%死于EBVaGC［3-4］。然而EBVaGC的发病机制尚未完全明确。已有研究表明脂代谢重编程与肿瘤进展息息相关［5-6］，是肿瘤抵抗细胞死亡和无限的增殖的重要支持，当血脂不能满足肿瘤快速生长时，需要通过从头合成获得更多脂质［5］，脂质合成酶表达和活性升高，细胞脂质含量升高。另外，病毒感染也能导致脂代谢的紊乱。近年来发现，肿瘤相关病毒如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、卡波西肉瘤疱疹病毒（KSHV）等导致的脂代谢重编程与肿瘤的发生发展紧密相关［7-9］。那么同为肿瘤相关病毒，EBV能否影响脂代谢呢？目前对EBV与脂代谢关系的研究只有四篇报导：单核细胞增多症中EBV感染能升高患儿血脂水平［10］；EBV编码的潜伏膜蛋白（LMP1）和EBV编码的小RNA（EBV encoded RNA，EBER）通过促进鼻咽癌细胞脂质合成，提高了鼻咽癌细胞增殖能力［11-12］；EBV立早蛋白（BRLF1）增强宿主细胞脂肪酸合成，从而促进EBV裂解［13］。EBV对胃癌脂代谢的影响在全世界尚未见有报道，本研究拟利用AGS和Akata细胞共培养建立EBV阳性细胞株AGSEBV，比较胃癌细胞AGS和AGS-EBV增殖、凋亡和脂代谢的差异，旨在从脂代谢的角度阐述EBV对胃癌细胞脂代谢的影响及EBVaGC发生发展的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

AGS细胞（EBV阴性胃癌细胞株）购于中国科学院上海细胞库，Akata细胞（EBV阳性Burkitt′s淋巴瘤细胞株）由中山大学附属肿瘤医院曾木圣教授馈赠。胎牛血清、RPMI1640培养基购于Gibco公司，磷酸盐缓冲液（PBS）、0.25%胰酶购于吉诺生物，G418购于凯基生物，TRIzol、异丙醇、无水酒精、氯仿等购于广州化学试剂厂，EBER-1原位杂交试剂盒购于中杉金桥，油红O染色试剂盒购于南京建成，游离脂肪酸定量试剂盒（ab65341）、甘油三酯定量试剂盒（ab65336）、胆固醇定量试剂盒（ab65359）购于Abcam公司，cDNA逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqⅡ）购于TaKaRa公司，CCK-8增殖检测试剂盒购于日本DOJINDO公司，Annexin V PE/7-AAD凋亡试剂盒购于美国BD公司。

1.2 AGS-EBV细胞株的建立

AGS与Akata细胞株共培养，Akata细胞中的重组EBV带绿色荧光蛋白（GFP）基因和新霉素抗性，通过CELL-TO-CELL方式使AGS感染EBV，800 μg/mL G418筛选14 d后获得稳定感染的AGS-EBV细胞株。

1.3 细胞培养

Akata细胞、AGS细胞和AGS-EBV细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。Akata细胞悬浮生长，细胞每日轻轻摇晃1次，隔天传代；AGS及AGS-EBV呈单层贴壁生长，细胞汇合率达80%进行传代。

1.4 EBER原位杂交

细胞培养到对数生长期，消化离心后去上清，40 g/L多聚甲醛固定，混合琼脂糖凝胶制成蜡块，以3 mm厚度切片。玻片脱蜡后，按说明书进行试验。EBER原位杂交后，细胞核呈黄棕色为EBER阳性。

1.5 CCK-8细胞增殖检测

将2 000细胞/孔铺到96孔板，每组设6个副孔。分别于0、24、48、72、96、120 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱孵育2 h，用酶标仪在450 nm检测吸光度。

1.6 细胞凋亡检测

以2×105细胞铺入6孔板，8 h后换液，培养48 h收集细胞。收集培养液，细胞消化离心并进行计数，将约5×105细胞与100 μL 1×binding buffer制成细胞悬液，加入5 μL PE溶液和5 μL 7-AAD溶液轻轻混匀，避光染色15 min，然后加入400 μL 1×binding buffer进行稀释，用BD公司的流式细胞仪检测AGS和AGS-EBV的凋亡比例。

1.7 油红O染色

将试剂盒中试剂一的储备液和稀释液按5∶2混合，慢速滤纸过滤，待细胞爬片自然干燥，置入试剂一染缸中10 min，37℃蒸馏水洗20 s，再试剂二复染3 min，自来水洗60 s。用加热至60℃的甘油明胶进行封片，镜下观察。脂滴被染成红色，细胞核被染成蓝色，其余组织为淡蓝色。

1.8 脂质含量检测

分别按游离脂肪酸定量试剂盒、甘油三酯定量试剂盒和胆固醇定量试剂盒说明书进行操作。同一试验在相同条件下重复3次，每次试验设2复孔，取平均值。

1.9 细胞RNA提取及实时定量荧光PCR

收集培养到对数期的AGS、AGS-EBV细胞并加入TRIzol试剂，按照RNA提取说明书的步骤提取总RNA，检测RNA的含量及纯度，再按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。实时定量荧光PCR（qRT-PCR）步骤参照说明书。使用仪器为Applied Biosystems 7500。引物（表1）由Invitrogen公司合成，PAGE纯化。PCR反应条件：95℃30 s，95℃3 s，60℃30 s，设置40个循环。同一试验在相同条件下重复3次，每次试验设3复孔，取平均值，使用 2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表1 脂代谢合成相关酶的引物序列Table 1 Primers sequences of real time PCR

1.10 统计学方法

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6软件进行统计分析和制图，计量资料以均数±标准差（x±s）进行描述。比较各组间的差异，符合正态分布且方差齐性的数据，采用t检验（方差不齐时用校正t检验），不符合正态分布或方差不齐的数据，采用秩和检验。比较重复测量数据采用MANOVA检验。双侧检验，检验水准定为α=0.05。

2 结果

2.1 EBV胃癌阳性细胞株AGS-EBV的建立

AGS与Akata细胞共培养，Akata细胞中带绿色荧光蛋白（GFP）基因和新霉素抗性的重组EBV通过CELL-TO-CELL方式感染AGS，感染了EBV的细胞能在蓝光激发下发出绿色荧光，另外，该细胞还表达EBER。因此荧光显微镜下绿色荧光和EBER原位杂交阳性均证明AGS-EBV中EBV感染成功（图1）。

2.2 EBV促进胃癌细胞株AGS增殖

绘制AGS和AGS-EBV体外增殖能力的生长曲线（图2）。AGS-EBV细胞增殖速度更快（F=23.214，P=0.001），从24 h开始AGS-EBV组细胞数（O.D value）多于AGS，两组差值在24～120 h的P值分别为0.007、0.004、＜0.001、＜0.001和＜0.001，差异有统计学意义。EBV促进胃癌细胞增殖能力增强。

图1 EBV成功感染AGS细胞Fig.1 AGS successfully infected by EBV

图2 EBV促进胃癌细胞AGS增殖Fig.2 EBV increased proliferation of AGS

2.3 EBV抑制胃癌细胞株AGS凋亡

AGS的早期凋亡率为2.79%±1.24%，晚期凋亡率为5.70%±1.65%，总凋亡率为8.48%±0.85%。AGS-EBV的早期凋亡率为1.50%±0.48%，晚期凋亡率为3.53%±1.35%，总凋亡率为5.03%±1.01%。两组细胞早期凋亡率（P=0.052）无统计学差异，AGS-EBV的晚期凋亡（P=0.032）和总凋亡率（P＜ 0.001）都低于AGS（表2，图3），提示EBV抑制胃癌细胞株AGS凋亡。

2.4 EBV促使胃癌细胞内的脂滴蓄积

脂滴被油红O着色呈红色点状小颗粒，均匀分布于细胞质。AGS-EBV组脂滴含量高于AGS组，提示AGS-EBV组细胞内脂质蓄积增多（图4）。AGS细胞内的游离脂肪酸含量（1.75±0.74）nmol/106cells，AGS-EBV细胞内的游离脂肪酸含量（3.38±0.59）nmol/106cells，AGS-EBV组含量高于对照组（P＜0.001）。AGS细胞内的甘油三酯含量（4.58±0.39）nmol/106cells，AGS-EBV的甘油三酯含量为（7.72±1.57）nmol/106cells，AGS-EBV组含量高于AGS组（P=0.004）。AGS细胞内总胆固醇含量为（7.49±0.50）μg/106cells，而 AGSEBV 为（13.13±0.64）μg/106cells，细胞内总胆固醇含量AGS组低于AGS-EBV组（P＜0.001；表3）。

表2 EBV抑制胃癌细胞株AGS凋亡Table 2 EBV suppressed apoptosis of AGS （n=3，%）

图3 EBV抑制胃癌细胞株AGS凋亡Fig.3 EBV decreased apoptosis of AGS

图4 EBV促进胃癌细胞脂质积聚Fig.4 EBV promoted lipid accumulating

表3 细胞内游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇含量Table 3 Detection of free fatty acid，triacylglycerol and total cholesterol（n=3）

2.5 EBV上调脂质合成酶mRNA表达

脂肪酸合成途径中，AGS-EBV组FASN、ACC1和ACC2的相对表达量分别为（1.18±0.22，t=-1.413，P=0.231），（1.54±0.32，t=-2.979，P=0.041）和（2.35±0.49，t=-5.225，P=0.014），FASN没有统计学差异，ACC1和ACC2表达均高于AGS组。在甘油三酯合成中，AGS-EBV组中相对表达量MOGAT1未测出，MOGAT2（4.25±1.32，t=-4.275，P=0.013）、MOGAT3（2.38±0.07，t=-36.560，P=0.001）、DGAT1（0.84±0.21，t=1.324，P=0.316）、DGAT2（0.82±0.12，t=2.590，P=0.122），MOGAT2、MOGAT3表达量高于对照组，DGAT1、DGAT2没有明显差异。在胆固醇酯合成过程中HMGCS1（1.83±0.17，t=-8.321，P=0.001）、HMGCR（1.67±0.21，t=-5.522，P=0.031）、ACAT1（2.07±0.36，t=-5.218，P=0.035）的相对表达量，均明显比AGS组表达量高。脂代谢的调节因子SREBP1（5.19±0.78，t=-10.253，P=0.002）、SREBP2（2.37±0.53，t=-4.476，P=0.046）在AGS-EBV组的相对表达量均高于对照组（图5）。

3 讨论

EBV是EBVaGC的致病因子，但EBV在EBVaGC发生发展的作用机制目前仍未得到完全阐明。本研究用CELL-TO-CELL接触感染的方法建立了EBV阳性的AGS-EBV细胞株，并检测了AGS和AGS-EBV的增殖和凋亡水平。结果发现，EBV能促进胃癌细胞增殖，抑制胃癌细胞凋亡。

图5 脂质合成酶的mRNA表达Fig.5 Relative mRNA level of lipogenesis enzymes

肿瘤细胞生长失调，是其无限增殖和凋亡失衡的共同结果，本研究提示EBV能促进胃癌细胞增殖。但别的学者有不同的意见，Jeong等［14］对AGS和AGS-EBV进行细胞计数，结果提示种板后5 d内两组没有差异，而第6、7天AGS的细胞数明显多于AGS-EBV组。Ishii等［15］对比EBVaGC与EBVnGC组织样本的Ki-67表达发现两组差别没有统计学意义。Jeong的实验中相同的细胞必须同时接种多个培养板，多次操作无法保证细胞量的恒定，而且细胞计数操作中消化和计数的过程步骤繁琐，也容易产生误差。Ishii对Ki-67百分率的判定依靠肉眼，过于主观。在我们的研究中，CCK-8实验只需接种一次细胞，而且检测过程简单，结果由电脑精确读数，因此我们更相信EBV促进了胃癌细胞增殖水平。

此外，过表达EBV编码潜伏膜蛋白LMP2A的胃癌细胞生长速度明显加快［16］；BARF1上调NF-kappaB/cyclin D1和细胞周期抑制剂p21以促进胃癌细胞增殖［17］。以上证据均支持EBV能促进胃癌细胞增殖。

同时凋亡检测发现相比对照组，AGS-EBV凋亡减少（图3）。Wang等和本课题组之前对胃癌组织样本的研究中，较EBVnGC而言，EBVaGC肿瘤细胞凋亡更少［18-20］。这些结果均说明，EBV的存在改变了胃癌细胞AGS的生长特性，使其对抗凋亡。总而言之，EBV通过促进细胞增殖和抑制凋亡以促进胃癌的发展。

在肿瘤细胞中，细胞增殖和凋亡抑制与代谢重编程息息相关。细胞内脂质尤其是脂肪酸和胆固醇，影响肿瘤的发生发展，包括肿瘤分级、分化程度，以及细胞增殖、凋亡、干性、侵袭性和上皮细胞-间充质转化等生物学行为［21］。病毒也能够通过调节细胞脂代谢来影响肿瘤进展，卡波西肉瘤疱疹病毒的蛋白K1、vGPCR激活PI3K/AKT/mTOR途径介导的FASN上调来维持原发性渗出性淋巴瘤的存活［22］。鼻咽癌中，EBV编码的LMP1、EBER提高宿主细胞的脂代谢水平，由此促进细胞增殖［11-12］。同是来源于上皮的EBV相关肿瘤——EBVaGC与脂代谢重编程之间的联系至今国内未见研究报道。于是我们通过检测AGS和AGSEBV的脂质含量和脂质合成酶表达，来探讨EBV对胃癌细胞脂代谢重编程的影响。

我们发现EBV使胃癌细胞内脂质含量升高。脂滴的基本组成为磷脂单分子层包裹着中心混合脂肪酸的中性脂质，主要成分包括甘油三酯、胆固醇酯和脂肪酸［23］。本研究的油红O染色提示AGS-EBV比AGS中有更多的脂质沉积，脂质定量试剂盒检测结果也显示游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇都有更高的含量，说明EBV使胃癌细胞的脂质含量升高。

肿瘤中脂质积累最可能是由于合成增多［24］，因此我们还检测了游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇这三种脂质重要的合成酶。脂肪酸合成有两个关键酶ACC和FASN，ACC将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，再由FASN将这两种物质逐步合成不同长度的脂肪酸（图6），我们发现ACC1、ACC2表达上调，说明EBV促进脂肪酸合成来获得更多脂肪酸。甘油三酯合成中，包含甘油一酯途径和甘油二酯途径，甘油一酯途径仅有一个代表性的酶MOGAT，经两个途径最终合成甘油三酯的最后一步都由DGAT催化（图6），我们发现MOGAT2、MOGAT3表达上调，说明EBV激活甘油一酯途径来合成更多甘油三酯。胆固醇合成和酯化有三个重要酶，乙酰辅酶A在HMGCR、HMGCS等酶催化下经30多步反应合成胆固醇，再被ACAT酯化成无细胞毒性的胆固醇酯（图6），我们发现HMGCS1、HMGCR、ACAT1表达上调，说明 EBV通过上调合成酶和酯化酶来促进胆固醇酯的合成。

哺乳动物细胞中还存在调节脂代谢的酶SREBP，通过与脂代谢酶基因的启动子区结合激活其转录。SREBP-1调控下游SCD1、FASN、ACC、ACSS2、ACLY等脂代谢基因的表达，参与脂肪酸合成、胆固醇的合成和摄取；SREBP-2促进下游脂代谢基因HMGCS、HMGCR、LDLR等表达，调控胆固醇合成和摄取［25］。实验发现AGS-EBV组SREBP1和SREBP2的mRNA表达水平分别约为对照组的5倍和2倍，说明EBV通过促进上游因子SREBPs表达来上调脂质合成酶。EBV感染是个复杂的过程，FASN、DGAT等没有发生变化，提示还可能存在其他途径调控脂质合成。

综上所述，本研究首次研究了EBVaGC的脂质代谢水平，发现EBV可能通过上调SREBPs来促进脂质合成，而且这极有可能是造成EBV促进胃癌细胞增殖加快、凋亡减少的原因。我们下一步将通过抑制实验进行验证，进一步阐明EBV通过脂代谢调节胃癌细胞增殖、凋亡的分子机制，并在胃癌组织标本上进行验证。脂质合成在正常体细胞中并不活跃，所以靶向抑制脂质合成对预防、诊断和治疗EBV相关的早期胃癌有很大潜力，值得在临床试验中做进一步研究。

图6 脂肪酸、甘油三酯和胆固醇酯合成示意图Fig.6 The schematic diagram of lipogenesis including fatty acid，triacylglycerol and cholesterol ester