组织悬液HER2阳性标本在免疫组化室内质控中作为阳性对照的作用和价值

吴 景，何 杰

（中国科学技术大学附属第一医院西区//安徽省肿瘤医院病理科，安徽合肥230031）

人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）是一种癌基因，与乳腺癌、胃癌和膀胱癌的预后密切相关，同时也是靶向治疗药物选择的一个重要靶点［1-3］。免疫组化是检测HER2蛋白表达的公认的方法［4］，但是依然存在少数患者由于检测结果不准确而接受了不当的治疗［5］，造成这种情况的原因是多方面的，不管是手工操作时的人为误差，还是机器染色时的机械故障，以及市场上种类繁多的抗体，都可能存在假阴性的风险。2019版乳腺癌HER2检测指南专家共识指出，免疫组化染色须设立阳性对照和阴性对照，被检测切片中癌旁正常乳腺上皮细胞可作为阴性内对照，外对照则以不同染色强度的组织芯片为最佳［4］。由于技术、成本等多种因素，组织芯片很难普及应用，随着免疫组化检测量的不断增加，保证日常质量监测的持续性是对病理技术工作的重大挑战。本文拟探讨组织悬液作为HER2阳性对照的可能性，提供一种更为简便、可靠的免疫组化室内质控方法。

1 材料与方法

1.1 样本来源

收集2015年1月至2018年12月安徽省肿瘤医院10%中性甲醛缓冲液固定的乳腺癌根治性切除样本20例，所有患者均签署知情同意书，研究中使用的组织标本经安徽省肿瘤医院伦理委员会批准。选择肿瘤组织丰富区域，免疫组化检测HER2表达3+，且HER2表达无明显异质性的样本，制作成5 mm×3 mm×3 mm的组织块进行脱水、包埋，备用。

1.2 试剂及仪器

一抗HER2（即用型兔单克隆抗体，克隆号4B5）、二抗及检测试剂盒均购自罗氏公司，使用罗氏BenchMark XT全自动免疫组化仪染色。

1.3 方法

1.3.1 组织悬液的制作 将制作好的石蜡块3 μm厚度连续切片200张，放入14 mL离心管，用玻璃搅拌棒轻轻搅碎，加入12 mL二甲苯，搅拌至石蜡溶解，放入离心机4 000 r/min（r=10 cm）离心2 min，弃上清，再加入二甲苯搅拌，重复离心过程3次。加入无水乙醇12 mL，搅拌均匀后离心，弃上清，此过程重复3次，以充分脱掉二甲苯为准，在最后去上清的沉积物中以1∶30的比例加入无水乙醇作为组织的保存液。染色时如发现细胞重叠较多，可适当增加无水乙醇量。组织悬液制备完毕后，保存于4℃冰箱。

1.3.2 免疫组化染色 使用前将悬液摇匀，同时准备两张防脱载玻片，采用10 μL加样枪每次吸取2 μL悬液滴加在载玻片上，待酒精挥发后，肉眼可见组织沉积。滴加完毕放入60℃烤箱，2 min后，取出一张采用罗氏BenchMark XT全自动免疫组化仪进行HER2免疫组化染色；另外一张进行常规HE染色。在制作后的1个月和3个月分别再进行两次免疫组化HER2染色，观察并记录两个时间段的染色定位和染色强度。选择归档的乳腺癌、胃癌HER2表达0、1+、2+、3+蜡块，3 μm厚切片，60℃烤箱烤片2 h，在玻片右下角滴加2 μL HER2 3+的组织悬液后进行免疫组化染色。

2 结果

20例组织悬液经HE染色，镜下均可见异型的癌细胞，癌细胞平铺，部分重叠，有一定组织结构，细胞轮廓清晰；免疫组化HER2染色均表达于细胞膜，染色强度3+（图1），与制作悬液前的组织蜡块比较，定位一致，强度相同。悬液制作后1个月和3个月对比，阳性定位及强度均无变化（图2）。作为乳腺癌与胃癌组织的阳性对照，可提供明确的阳性参考（图3，4）。

3 讨论

临床研究结果显示，化疗联合曲妥珠单抗（赫赛汀）治疗可显著延长乳腺癌患者的生存期，然而，仅HER2基因扩增或蛋白过度表达的患者才可以从赫赛汀治疗中受益。因此，HER2状态的检测对于是否进行赫赛汀治疗和判断临床预后具有十分重要的意义。

图1 制作悬液前的组织HER2免疫组化染色及组织悬液HE染色、HER2免疫组化染色比较Fig.1 Comparison of HER2 immunohistochemical staining of the tissue before prepared into suspension，HE staining of tissue suspension，and HER2 immunohistochemical staining of tissue suspension

图2 制作1个月和3个月的组织悬液HER2免疫组化染色Fig.2 HER2 immunohistochemical staining of tissue suspension in the first and third month

为确保HER2结果的可靠性，应严格做好免疫组化检测时的质量控制［6］。在染色过程中设立阳性对照是进行染色质量控制的重要措施之一。在2015年，国际特设专家委员会推荐了18种病理诊断中常用抗体所对应的阳性对照组织［7］。新版HER2检测指南指出以不同染色强度的组织芯片作对照为最佳，国外文献多使用组织芯片或手工制作多组织的“香肠”块达到精准的染色对照［8］，国内报道采用羊膜卷对照的方式也有类似的效果［9］，但制作多组织的芯片工作量大，对技术要求高［10］。如果使用商业化的质控品替代，亦会产生高昂的耗材成本，对于基层医院很难普及。ADDIN EN.CITE［10-11］目前国内使用最多的还是单组织的直接蜡块对照法，但是随着HER2检测需求量不断增大，每日为每例待检样本切取阳性对照组织耗时耗力，而且需要消耗大量的组织样本，难以全部实行严格的对照。国内丁伟等也曾报道利用罗氏公司的培养细胞制作均浆液运用于HER2免疫组化检测［11］，亦是为了简化质控流程，便于推广执行。实验证明组织悬液的制备简单，染色质量稳定，保存时间长久，一次制作可满足长期的检测需求，节省人力；滴加对照的方式快捷，亦能满足同张玻片多块组织同时进行检测的对照，从而更易实现对每张切片的质控，而且组织悬液所需的样本量少，利用大体取材剩余的组织，来源充足，不会耗损患者存档的石蜡样本。

图3 乳腺癌HER2免疫组化染色及相应的组织悬液对照染色Fig.3 HER2 immunohistochemical staining of breast cancer and corresponding tissue suspension contrast staining

在检测后若发现悬液HER2染色阴性或者阳性减弱，应对该染色过程产生怀疑，查明原因后，该待检样本需另外加阳性的石蜡组织对照，重新检测以验证染色的结果。另外，经反复实验滴加在切片上的悬液组织黏附牢固，未发现有对待检样本污染的现象。考虑到罗氏BenchMark XT全自动免疫组化仪染色冲洗的方向是由玻片标签端冲向末端，故本研究方案选择在玻片末端右下方添加对照，亦是为了降低可能产生组织污染的概率。

综上所述，滴加悬液对照的方式更加简便、易操作，悬液内的组织染色质量稳定、定位准确、易判读，阳性对照的准确表达保障了染色过程的可靠性。因此，该方法应用于HER2免疫组化室内质控，简便、可靠、实用且易推广。

图4 胃癌HER2免疫组化染色及相应的组织悬液对照染色Fig.4 HER2 immunohistochemical staining of gastric cancer and corresponding tissue suspension contrast staining