伊马替尼抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症表型

王乐旬，吴惠娟，张盛昔，杨 潇，郭 姣

（1.广东省代谢病中西医结合研究中心//广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室//粤港澳联合代谢病重点实验室//广东药科大学中医药研究院，广东广州510006；2.华南理工大学附属第二医院//广州市第一人民医院检验科，广东广州510180）

伊马替尼（imatinib，Ima），是一种强效的小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI），能够与ATP竞争性结合蛋白激酶的激酶结构域，抑制激酶活性［1］。伊马替尼首先被用于慢性粒细胞白血病的治疗［1］，后来又被用于胃肠间质瘤等实体肿瘤［2］，都取得很好的疗效。随着研究的深入，发现在心脏纤维化［3］以及一些免疫相关的疾病，如间质性肺炎［4］、系统性硬化［5］，伊马替尼具有较好的治疗作用。这表明伊马替尼具有调控免疫的作用，但其具体机制仍需进一步的研究。作为固有免疫的重要组分，巨噬细胞因具有很强的可塑性，在机体免疫活动中扮演着极其重要的角色。根据功能和表型的不同，巨噬细胞可分为M1型和M2型［6］。M1型巨噬细胞可由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导，可释放大量的炎症因子，如白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，参与炎症反应、清除体内病原体和发挥抗肿瘤免疫作用；M2型巨噬细胞可被IL-4诱导，因其能够分泌具有抑制炎症作用的IL-10，而发挥抗炎、修复损伤以及促进肿瘤形成的作用［7-8］。每一种型别巨噬细胞的活化过度或不足，都会引起相应的病理变化［9］。对于巨噬细胞型别改变的研究成为了免疫学领域的热点。然而，伊马替尼对巨噬细胞的影响仍待深入研究。本研究以LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7，构建体外细胞炎症表型模型，观察伊马替尼对该模型相关细胞因子表达的影响，并初步探讨其对相关信号通路蛋白活性的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

胎牛血清和DMEM为Gibco品牌；ECL发光液、HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自美国Thermo Fisher Scientific公司；青霉素、链霉素、LPS购自Sigma-Aldrich公司；Imatinib购自美国Selleck公司；硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品；iNOS抗体购自Abcam公司；GAPDH抗体购自ProteinTech公司；p-Abl、Abl、p-p65、p65、p-p38、p38、p-AKT、AKT、p-ERK和ERK抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；RNAiso-Plus试剂为日本 TAKARA 公司产品；IL-10、TNF-α、IL-1β和CCL2的ELISA试剂盒为上海吉泰依科赛生物科技有限公司的产品；逆转录试剂盒（ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover）和荧光定量PCR试剂盒（KOD SYBR®qPCR Mix）购自日本TOYOBO公司；蛋白定量试剂盒购自武汉博士德公司；牛血清白蛋白（BSA）、Western细胞裂解液为碧云天公司产品。

1.2 细胞株

小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，用含有100 mL/L的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL的链霉素的DMEM培养基于37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.3 所需仪器

ME104TE天平为瑞士METTLER-TOLEDO公司产品；Mithras LB-940酶标仪购自德国Berthold公司；冷冻离心机5810R购自德国Eppendorf公司；微型电泳仪及转膜仪来自美国Bio-Rad公司；PikoReal实时荧光定量PCR仪为Thermo Fisher Scientific产品。

1.4 细胞处理

取对数生长期的RAW264.7细胞种于6孔板中，每孔5×105个细胞。过夜贴壁后，利用无血清的DMEM培养基饥饿培养24 h，设置对照组、LPS组（0.1 μg/mL）、Ima1组（1 μmol/L）、Ima 5组（5 μmol/L）、LPS+Ima1组和LPS+Ima 5组，Ima提前预处理2 h，然后加LPS处理8 h或24 h，收集细胞提取mRNA或蛋白质。

1.5 Q-PCR检测细胞内mRNA表达

1.5.1 mRNA提取 将1 mL的RNAiso Plus加入培养板中，用移液器反复吹打混匀，吸入EP管中，加入0.2 mL的氯仿，混匀，室温静置5 min，10 000 ×g，4℃离心15 min后，移上层液至另一洁净的EP管中，加入与上清液等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置5 min，4℃，10 000×g离心10 min后，小心弃上清加入1 mL的75%乙醇，混匀，4℃，8 000×g离心5 min，超净台中干燥5～10 min，加25～50 μL预热至60℃的DEPC水溶解。测浓度后，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录成cDNA。

1.5.2 Q-PCR过程 引物由上海英潍捷基公司合成，序列见表1。反应总体系为10 μL，qPCR Mix 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，去离子水3.7 μL。反应程序如下：95 ℃，3 min；95℃，30 s，60℃，15 s，40个循环。GAPDH作为内参，将所得Ct值按 2-ΔΔCt方法进行数据处理。

表1 Q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Q-PCR

1.6 Western Blot检测细胞内蛋白的变化

1.6.1 细胞蛋白提取 细胞处理24 h后，用PBS洗涤两次，完全去掉洗液后，加入蛋白裂解液100～150 μL，用细胞刮刀刮取细胞，用枪吹打后，10，000×g，4℃，离心15 min，收集上清液，按照蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，选择同样浓度的蛋白量加入上样缓冲液，100℃煮沸10 min。

1.6.2 Western Blot 配制SDS-PAGE凝胶，浓缩胶为5%，分离胶为10%。将上述煮过后的样品加入凝胶孔中，浓缩胶80V电压，待样本跑至分离胶中，将电压调至120 V，一直跑完。经湿转法将分离胶中蛋白转至硝酸纤维素膜中，用含5%BSA的TBST液摇床封闭1 h，换相应蛋白的一抗稀释液（1∶1 000），4℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。用二抗稀释液（1∶10 000）室温孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min，ECL发光液显色，胶片于暗室中曝光，晾干胶片，扫描分析。

1.7 ELISA检测细胞上清因子的含量

收取刺激24 h的细胞培养上清，按照试剂盒说明书的操作检测IL-10、TNF-α、IL-1β和趋化因子配体 2［chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2］的含量。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件（美国GraphPad Software公司）进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示。样本数据首先进行正态性检验和方差齐性检验，对于符合正态分布且方差齐性的数据，采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用Tukey检验；不符合正态分布或方差不齐的数据采用H检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS诱导巨噬细胞向炎症表型极化

LPS为大多数革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，能够引发哺乳动物强烈的免疫反应［10］，并能诱导巨噬细胞向M1型（炎症型）极化［6］。首先我们检测了LPS对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的影响。实验结果显示，LPS（0.1 μg/mL）处理8 h后，巨噬细胞内iNOS（M1型分子标记）的mRNA和蛋白质水平和对照组比都显著升高（F=177.1，P ＜ 0.001；图1、2），这表明LPS诱导巨噬细胞向M1型极化。另外，对炎症因子TNF-α、IL-1β和CCL2的mRNA和蛋白检测显示，LPS能够刺激细胞内TNF-α、IL-1β和CCL2的mRNA的转录［TNF-α（F=49.47，P ＜ 0.001），IL-1β（F=1231，P ＜ 0.001），CCL2（F=222.6，P ＜ 0.001）；图1］，以及刺激细胞分泌TNF-α、IL-1β和CCL2蛋白［TNF-α（F=165.8，P ＜ 0.001），IL-1β（F=66.48，P ＜ 0.001），CCL2（F=195，P ＜ 0.001）；图2］。结果表明，LPS能够诱导巨噬细胞向炎症性表型（M1）分化。

2.2 伊马替尼抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的转录

和LPS组比较，伊马替尼（1 μmol/L和5 μmol/L）提前2 h预处理后，能够显著降低由于LPS刺激而升高的iNOS、TNF-α、IL-1β和CCL2的mRNA水平［iNOS（F=177.1，P ＜ 0.001），TNF-α（F=49.47，P ＜ 0.001），IL-1β（F=1231，P ＜ 0.001），CCL2（F=222.6，P ＜ 0.001）］，且这种抑制作用具有剂量依赖性（图1）。而单独利用伊马替尼处理RAW264.7细胞，对上述四种基因的mRNA水平没有明显的改变［iNOS（F=177.1，P=0.993），TNF-α（F=49.47，P ＞ 0.999），IL-1β（F=1231，P ＞ 0.999），CCL2（F=222.6，P ＞ 0.999）；图1］。结果提示，伊马替尼不会导致巨噬细胞向炎症表型极化。

图1 伊马替尼对LPS诱导的炎症因子mRNA的影响Fig.1 The effects of Ima on the mRNA of inflammatory cytokines induced by LPS

2.3 伊马替尼抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子蛋白的表达

接下来，我们检测了炎症因子蛋白表达的变化。Western Blot结果证实LPS能够显著增强RAW264.7细胞iNOS的蛋白表达，而伊马替尼预处理后能够降低LPS引起的iNOS蛋白水平的增高（图2A）。通过ELISA方法检测细胞上清中TNF-α、IL-1β和CCL2的蛋白水平，结果显示伊马替尼的预处理能够显著抑制由LPS引起的蛋白水平的升高［TNF-α（F=165.8，P ＜ 0.001），IL-1β（F=66.48，P ＜ 0.001），CCL2（F=195，P ＜ 0.001）；图2B］。结果提示，伊马替尼不仅能够抑制LPS引起的炎症因子mRNA转录的增加，还能够抑制因LPS刺激引起的炎症因子蛋白水平的升高。

图2 伊马替尼对LPS诱导的炎症因子蛋白表达的影响Fig.2 The effects of Ima on the protein levels of inflammatory cytokines induced by LPS

2.4 伊马替尼对LPS诱导的NF-κB和MAPK信号通路的影响

由于NF-κB和MAPK信号通路在炎症反应中发挥重要的作用［11］，我们检测了不同处理对巨噬细胞NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白（p65、p38和ERK）的影响。和之前的报道一致［12］，LPS能够使p65、p38和ERK的磷酸化水平显著升高（图3）。另外，LPS还能够增强AKT的磷酸化水平（图3）。伊马替尼预处理后，显著抑制p65、p38、ERK和AKT的磷酸化水平（图3）。我们的实验和其他研究［12］一致表明，伊马替尼能够抑制因LPS刺激而过度激活的NF-κB和MAPK信号通路。由于伊马替尼是BCR-ABL融合蛋白中Abl激酶的特异抑制剂，我们也检测了对巨噬细胞Abl活性的影响。结果显示，伊马替尼处理能够显著抑制Abl的磷酸化水平。

2.5 伊马替尼对LPS诱导巨噬细胞促炎因子的影响

图3 伊马替尼对LPS诱导的细胞信号通路的影响Fig.3 The effects of Ima on the signaling pathways induced by LPS

由于炎症型（M1）和抑炎型（M2）是巨噬细胞的两种相反的功能状态，而IL-10作为抑炎的主要因子，也是M2的主要指标之一［11］。接下来我们检测了不同处理下RAW264.7细胞抑炎型因子（IL-10）的变化。结果显示，LPS也可刺激巨噬细胞IL-10的mRNA的转录和蛋白的表达［mRNA水平（F=201.8，P ＜ 0.001），蛋白水平（F=181.8，P ＜ 0.001）］，但并没有增强Arg1（M2分子）的转录（F=56.7，P=0.071；图4）。而伊马替尼处理后，不仅能够显著增强LPS引起的IL-10的mRNA转录水平和其蛋白表达水平，还能够刺激Arg1的mRNA转录［IL-10 mRNA水平（F=201.8，P＜0.001），IL-10蛋白水平（F=181.8，P ＜0.001），Arg1 mRNA水平（F=56.7，P ＜ 0.001）；图4］。这些结果提示，伊马替尼不仅抑制了LPS诱导的巨噬细胞炎症表型，还能够使巨噬细胞向抑炎表型发展。

图4 伊马替尼对LPS诱导的抑炎因子的影响Fig.4 The effects of Ima on the mRNA of anti-inflammatory cytokines induced by LPS

3 讨论

炎症是机体对损伤作出的反应，属于免疫反应的一部分。尽管它能保护机体免受病原体的侵害，但不受控制的炎症会引发诸如哮喘、过敏性鼻炎和动脉粥样硬化等疾病［13］。巨噬细胞在炎症/免疫反应中发挥着重要的作用，它们因周围微环境的不同，会极化成不同的类型，进而发挥不同的功能［6］。M1型巨噬细胞通过分泌炎症因子而引起或加重炎症、抑制肿瘤，而M2型细胞则主要调控免疫反应和组织重塑，进而促进肿瘤［6］。抑制炎症型（M1）巨噬细胞中炎症因子的合成对炎症具有治疗作用。本文研究了伊马替尼对炎症型巨噬细胞的影响，证实伊马替尼不仅能够抑制M1型巨噬细胞的炎症因子TNF-α，IL-1β和CCL2的表达及分泌，同时还能够刺激巨噬细胞对抑炎因子IL-10的分泌以及M2型巨噬细胞的分子标记Arg1的表达。

LPS，又被称为细菌内毒素，作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要脂质成分，是生物医药学研究领域中的关键分子。高剂量时，可引发机体微循环障碍、休克以及弥散性血管内凝血等病理现象；低剂量时可刺激机体的TNF-α和IL-1β的释放，引起炎症［14］。研究显示，LPS可通过与固有免疫细胞膜上Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）和髓样分化蛋白2（myeloid differentiation protein-2，MDP-2）形成的复合体结合，激活细胞内NF-κB和MAPK信号通路，从而刺激TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL2等炎症因子的释放，引起炎症［15-17］。在细胞学实验中，LPS常常被用作炎症诱导剂来构建炎症的细胞模型［16-18］。和上述研究的结果一致，我们利用剂量为0.1 μg/mL的LPS处理RAW264.7细胞，细胞内的TNF-α、IL-1β、CCL2以及M1型巨噬细胞的分子标记iNOS的基因水平以及蛋白质水平都显著升高，这表明已成功构建炎症细胞模型，同时也证实LPS诱导巨噬细胞向M1型极化。

TNF-α和IL-1β作为经典的炎症因子，在炎症反应中得到广泛和深入的研究［19］。TNF-α和IL-1β主要由活化的单核/巨噬细胞分泌，分别与其受体（TNFR1/R2，IL-1R1）结合，进而调控靶细胞的活性和功能，如促使髓系细胞和淋巴细胞的活化、影响其他细胞因子及趋化因子的分泌、促进血管生成以及上调血管内皮以及血液细胞对黏附分子的表达，进而启动和维持炎症反应［19］。研究显示，LPS可通过巨噬细胞中NF-κB和MAPK信号通路上调TNF-α和IL-1β的表达及分泌［16-17］。和上述研究一致，我们证实LPS可诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中NF-κB通路p65蛋白及MAPKs通路p38和ERK蛋白的活化。而伊马替尼预处理后，能够显著抑制p65、p38和ERK活化水平。这表明伊马替尼抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1β表达是通过抑制由LPS刺激的NF-κB和MAPKs信号通路超活化来发挥的。然而，有研究显示伊马替尼对LPS+IFNγ刺激的RAW264.7细胞中TNF-α和iNOS的表达没有影响［20］。之所以出现不一致，可能有以下原因：①处理方式不同。本实验中是伊马替尼预处理2 h后，再加LPS（0.1 μg/mL）处理8 h，而Yao等是将LPS、IFNγ和伊马替尼同时加入细胞培养基中；②LPS所用剂量不同。通常认为单独的LPS即可诱导巨噬细胞向M1型极化，所需剂量一般都在50 ng/mL以上［16-18］。我们选用了0.1 μg/mL的剂量，而Yao等用的2.5 ng/mL的LPS和0.125 ng/mL的IFNγ；③刺激时间不同。我们选用的刺激时间是8 h，而Yao等刺激时间为24 h；④伊马替尼所用剂量不同。我们选用了1 μmol/L和5 μmol/L两个浓度梯度，而Yao等所用伊马替尼的剂量多为2.5 μmol/L。

CCL2，又被称为单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），主要由单核细胞、巨噬细胞以及树突状细胞分泌，与靶细胞膜上的受体CCR2/4结合后，可以趋化单核细胞、T淋巴细胞以及树突状细胞等迁移到损伤部位或感染部位。一般认为CCL2是炎症反应中的启动因子，其通过正反馈的作用刺激其他炎症因子的合成和释放。LPS能够刺激BV2细胞（小胶质细胞，大脑中的巨噬细胞）和RAW264.7细胞中CCL2的合成和分泌［21-22］。这表明，CCL2可作为炎症模型中的一个检测指标。在本实验中，我们也证实0.1 μg/mL的LPS能够显著刺激RAW264.7细胞中CCL2的表达。伊马替尼预处理后，能够显著抑制CCL2的超表达。上述结果说明，伊马替尼具有抑制巨噬细胞炎症表型的作用。

IL-10可由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等多种细胞分泌，在免疫/炎症反应中的作用主要表现为免疫/炎症抑制。IL-10作用于CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞后，抑制其活化，进而抑制机体的免疫反应，使得感染持续［23］。IL-10通过与靶细胞膜上受体IL-10R结合后，激活细胞质中STAT3信号通路，抑制Th1免疫反应以及炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β等的分泌［23］。另外，IL-10通过细胞因子信号转导抑制因子-3（suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3）抑制 LPS诱导的巨噬细胞活化［23］。然而，有研究显示，LPS可上调巨噬细胞中IL-10的表达［24］。和后一种情况类似，我们的实验证实，LPS可诱导巨噬细胞中IL-10的表达和分泌。我们猜测，由于0.1 μg/mL的LPS强烈刺激炎症因子的合成和释放，其所刺激IL-10产生的量不足以抑制其诱导巨噬细胞活化的作用。有意思的是，伊马替尼预处理后，IL-10的mRNA和蛋白质水平增加的更为明显。这些结果表明，伊马替尼在在抑制LPS诱导的炎症型巨噬细胞的同时，促进了抑炎因子的表达。结果也提示伊马替尼可能促使M1巨噬细胞向M2转化。

到现在为止，伊马替尼对M2型巨噬细胞的影响仍存在分歧。有研究显示，在体外利用RAW264.7细胞进行的实验中，伊马替尼能够抑制IL-4或IL-13诱导的M2巨噬细胞极化［20］。体内实验也证实伊马替尼能够抑制巨噬细胞向M2方向极化［20］。然而，也有一些研究显示，伊马替尼对M2型巨噬细胞的型态和功能没有影响［25］。在本实验中，伊马替尼能够诱导LPS活化的巨噬细胞中的M2分子标记（IL-10和Arg1）的表达，而单独利用伊马替尼处理RAW264.7细胞（未活化状态），这些指标则没有明显的改变。这提示，对于未活化的巨噬细胞，伊马替尼没有明显的作用，而是对活化的细胞则有明显的调控作用。伊马替尼诱导M2巨噬细胞极化可能是伊马替尼治疗实体肿瘤发生肿瘤耐药的机制之一，具体的机制仍需进一步的研究。

综上，本实验证实伊马替尼能够抑制LPS诱导的炎症型巨噬细胞的极化，其作用机制与抑制LPS刺激引起的NF-κB和MAPK信号通路的超活化有关。本研究为伊马替尼在炎症性疾病中的应用提供了依据。