视黄酸-AP-1信号通路对视网膜色素上皮细胞分泌TGF-β2的调控机制

陈子成，吴君舒，余颖鑫，李凯婧

（1.广州医科大学附属第二医院眼科，广东广州510260；2.中山大学中山眼科中心//眼科学国家重点实验室，广东 广州510060）

近视是世界范围内最常见的眼部异常之一，He［1-2］的研究表明80%到90%的青少年患有近视，其发生率之高和危害性之大已被人们高度关注，而目前近视的发病机制尚不明确。研究表明，在使眼球生长加快的视觉条件下（遮盖或戴负镜），视网膜中视黄酸（retinoic acid，RA）水平升高［3］，而RA与视黄酸受体（retinoic acid receptor，RAR）结合后能诱导视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）分泌转化生长因子β2（transfer growth factor-β2，TGF-β2）。RA和TGF-β2是目前研究较多、与近视密切相关的活性因子［4］，而活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是诸多细胞信号传导途径在细胞核内的交汇点，在近视发生中亦发挥重要作用［5］，作为与视觉依赖性眼球生长密切相关的信号分子，RA、AP-1和TGF-β2上下游调控关系未明。本研究采用RA的异构体——全反式视黄酸（All-trans retinoic acid，ATRA）、RAR抑制剂LE540和AP-1抑制剂T-5224干预人RPE细胞，观察药物干预对RPE细胞分泌TGF-β2的影响，探究RA参与调控RPE分泌TGF-β2的相关途径，此外，RA受体、AP-1及相关信号元件也可能成为研发近视防治药物的靶点，为近视的防治提出新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人RPE细胞（ARPE-19细胞系）由中山大学中山眼科中心李万程教授课题组惠赠，DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，LE540购自日本Wako公司，T-5224购自美国APExBIO公司，全反式视黄酸（All-trans retinoic acid，ATRA）购自美国Sigma公司，Anti-Retinoic Acid Receptor beta抗体、Anti-c-Fos抗体、Anti-TGF-β2抗体、Anti-GAPDH抗体及山羊抗兔IgG H&L（HRP）购自美国Abcam公司，BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，人TGF-β2 Elisa试剂盒购自武汉云克隆公司，EMSA试剂盒LightShift®Chemiluminescent EMSA Kit购自Thermo公司。

1.2 细胞培养及干预

于37℃、体积分数为5%的CO2恒温培养箱中，用含10%FBS及1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基培养ARPE-19细胞，按1∶3或1∶4传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。将ATRA、LE540和T-5224溶于DMSO后按预实验结果用DMEM/F12分别稀释成10-6mol/L ATRA、10-6mol/L LE540和10-6mol/L T-5224，避光保存。本实验有6个实验组：ATRA组、LE540组、T-5224组、ATRA+LE540组、ATRA+T-5224组，DMEM/F12组作为空白对照。

1.3 Western Blot免疫印迹

先用 ATRA 分别干预 6、12、24、48 h，再用ATRA、LE540和ATRA+LE540干预48 h，DMEM/F12作为对照，收集各组RPE细胞，用RIPA裂解液提取蛋白质，并用BCA法进行蛋白定量，行10%SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，分别加入兔抗人RARβ（1∶1 000）、兔抗人c-Fos（1∶2 000），兔抗人 TGF-β2（1∶1 000），GAPDH（1∶10 000），4℃过夜，洗膜后加入对应种属的二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，最后用HRP底物试剂盒检测信号，显影。

1.4 Real-Time PCR

将细胞接种于6孔板，培养细胞待接近90%融合时，更换无血清DMEM/F12培养基饥饿培养24 h，按western blot实验分组对细胞进行干预，收集细胞用Trizol提取试剂提取各组总RNA，根据所测RNA浓度及纯度，按照逆转录试剂盒要求依次加入各试剂，将总RNA逆转录成cDNA，引物如下RARβ：Forward，CGTGGAGTTTGCTAAACGTCT；Reverse，TGGTGTCTTGTTCTGGGGTAT。c-Fos：Forward，AGAATCCGAAGGGAAAGGAA；Reverse，CTTCTCCTTCAGCAGGTTGG。GAPDH：Forward，ATGGCCACGGCTGCTTCCAGC；Reverse，CATGGTGGTGCCGCCAGACAG。按Takara的PrimeScriptRT reagent Kit试剂盒说明操作，同时扩增目的基因和GAPDH，按仪器给出的CT值计算目的基因的相对表达量，样本中目的基因相对表达量按照2-ΔΔCt进行计算。

1.5 免疫荧光

将细胞接种于多聚赖氨酸包被的小圆片上，实验组用ATRA处理48 h，对照组用DMEM/F12处理相同时间后，用40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，山羊血清封闭30 min，分别加入一抗RARβ（浓度1∶100），c-Fos（浓度1∶100），4 ℃过夜，洗去未特异结合的一抗，避光分别加入荧光二抗（浓度1∶500），室温孵育1 h，洗去未特异结合的二抗，室温10 min孵育DAPI，清水洗去多余DAPI，加入抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察。

1.6 电泳迁移率变动分析法

将细胞接种于大皿，用T-5224分别干预12 h、24 h、48 h，DMEM/F12作为对照组，按照LightShift Chemiluminescent EMSA Kit说明书进行。合成生物素标记的探针，探针序列为 AP-1：Forward，5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′；Reverse，5′-TTCCGGCTGAGTCATCAAGCG-3′。用0.5×TBE配制6～8%聚丙烯酰胺凝胶，100 V预电泳30～60 min，配制反应体系，结合反应体系在室温孵育20 min，加入5 μL 5×上样缓冲液，轻轻混匀，上样后，于100 V电压电泳至凝胶全长3/4处，将尼龙膜在0.5×TBE中浸泡10 min，380 mA湿转30 min，室温晾干，紫外交联125 mJ/cm290 s，显色，封闭液封闭15 min，按1∶300浓度稀释，加入链霉卵白素-辣根过氧化物酶偶联物，室温作用15 min，用1×洗液作用5 min，共4次，再加入底物平衡缓冲液作用5 min，按1∶1比例加入鲁米诺增强液和稳定的过氧化物溶液，暗室显色。

1.7 酶联免疫吸附试验

将细胞接种于6孔板，用无血清培养基饥饿24 h，将细胞分别用ATRA、ATRA+LE540、ATRA+T-5224干预48 h，DMEM/F12作对照组，收集各孔细胞上清，样本检测前在-80℃储存，按照ELISA检测试剂盒的说明书操作。

1.8 统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件做统计处理。计量资料以均数±标准差表示，数据处理：两样本间比较，数据呈正态分布且方差齐时采用t检验，数据方差不齐时采用校正的t检验；多组间比较，数据呈正态分布方差齐性时采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；不同时间点的实验组和对照组数据采用Dunnett′s t检验进行比较，进一步采用Bonferroni法作其他组间两两比较，方差不齐时采用Kruskal Wallis检验比较；重复测量资料采用重复测量的方差分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATRA对ARPE细胞中RARβ、c-Fos基因表达的影响

用qPCR检测各时间段细胞中RARβ和c-Fos mRNA的表达。结果显示，处理组与对照组间、不同时间及组别与时间的交互作用均有统计学意义（P ＜0.05；表1、3）。组间比较：与对照组相比，细胞中RARβ mRNA的表达水平在24和48 h分别增加56.14%和89.17%，差异具有统计学意义（P＜0.05；表2、图1A）；c-Fos mRNA的表达在12 h和24 h分别增加89.51%和23.15%，差异具有统计学意义（P＜0.05；表4、图1B）；在48 h时，干预组和对照组的c-Fos mRNA表达无明显差别，差异无统计学意义（P＞0.05；表4、图1B）。不同时间点比较：与6 h干预组相比，细胞中RARβ mRNA的表达水平在干预24和48 h后分别增加54.18%和85.58%，差异具有统计学意义（P＜0.05；表2、图1A）；与12 h干预组相比，干预48 h后c-Fos mRNA的表达减少44.15%，差异具有统计学意义（P＜0.05；表4、图1B）。

表1 应用重复测量方差分析探讨ATRA对ARPE-19中RARβ表达的影响Table 1 Analysis of the effect of ATRA on RARβ expression in ARPE-19 by using repeated measurement analysis of variance （n=4）

表2 qPCR分析ATRA对ARPE-19细胞中RARβ mRNA的表达水平Table 2 The mRNA expression of RARβ in ARPE-19 after being treated with ATRA detected by qPCR （x±s）

表3 应用重复测量方差分析探讨ATRA对ARPE-19中c-Fos表达的影响Table 3 Analysis of the effect of ATRA on c-Fos expression in ARPE-19 by using repeated measurement analysis of variance （n=4）

表4 qPCR分析ATRA对ARPE-19细胞中c-Fos mRNA的表达水平Table 4 The mRNA expression of c-Fos in ARPE-19 after being treated with ATRA detected by qPCR （x±s）

2.2 ATRA对ARPE细胞中RARβ和c-Fos蛋白表达的影响

采用western blot观察ATRA诱导0～48 h后RARβ和c-Fos蛋白的表达。结果显示，细胞中RARβ蛋白的表达水平随着干预时间的增加而上升，组间差异有统计学意义（F=72.173，P＜0.01，图2A），在24和48 h时，RARβ的表达与对照组相比分别增加45.19%和84.07%，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2A）。c-Fos蛋白的表达水平随着干预时间的延长表现为先上升后下降，组间差异有统计学意义（F=20.377，P ＜0.001，图2B）。c-Fos表达在12 h组时较对照组增加94.34%，48 h组与对照组相比差异无统计学差异（P＞0.05，图2B），而48 h组较12 h组表达减少35.64%，差异具有统计学意义（P＜0.01，图2B）。

2.3 免疫荧光检测ATRA干预后RARβ和c-Fos蛋白在细胞中的表达

免疫荧光结果显示，ARPE-19细胞在ATRA干预48 h后，RARβ在细胞核和细胞质的表达较对照组升高，而c-Fos在细胞核的表达较对照组无明显变化，与Western Blot结果相符（图3）。

图1 ATRA对ARPE-19细胞RARβ和c-Fos基因表达的影响Fig.1 RARβ and c-Fos expression in ARPE-19 after being treated with ATRA

图2 ATRA对ARPE-19细胞RARβ和c-Fos蛋白表达的影响Fig.2 RARβ and c-Fos expression in ARPE-19 after being treated with ATRA

图3 免疫荧光检测ATRA干预后RARβ和c-Fos在ARPE-19细胞中的表达Fig.3 Detection of RARβ and c-Fos expression in ARPE-19 after being treated with ATRA by immunofluorescence

2.4 LE540对ARPE细胞中RARβ及c-Fos基因表达的影响

qPCR结果显示：与对照组相比，ATRA组RARβ基因表达增加105.41%（P＜0.01），与ATRA组相比，ATRA+LE540组RARβ基因表达减少22.83%（P＜0.05），组间差异具有统计学意义（F=96.210，P ＜0.001，图4A，表5）。与对照组相比，ATRA组c-Fos基因表达无统计学差异（P＞0.05），而LE540组c-Fos表达增加75.66%（P＜0.01）。与ATRA组相比，ATRA+LE540组细胞c-Fos基因表达增加75.53%（P＜0.01），组间差异具有统计学意义（F=36.884，P ＜ 0.001；图4B，表5）

2.5 LE540对ARPE细胞中RARβ及c-Fos蛋白表达的影响

Western blot结果显示：与对照组相比，ATRA组 RARβ蛋白表达增加 93.96%（P＜0.01）；与ATRA组相比，ATRA+LE540组RARβ蛋白表达减少25.84%（P＜0.05），组间差异具有统计学意义

表5 qPCR分析LE540干预后ARPE-19细胞中RARβ和c-Fos mRNA的表达水平Table 5 The mRNA expression of RARβ and c-Fos in ARPE-19 after being treated with LE540 detected by qPCR （x±s）

RARβ：n=4，1）P＜0.05vs.control by Dunnett′sttest after ANOVA.2）P＜0.05vs.ATRA group by a Bonferroni post hoc test after one-way ANOVA.c-Fos：n=4，1）P＞ 0.05 and 2）P＜ 0.01vs.control by Dunnett′s t test after ANOVA.3）P＜0.01vs.ATRA group by a Bonferroni post hoc test after one-way ANOVA（F=32.299，P＜0.001，图5A）。与对照组相比，LE540组c-Fos蛋白表达增加62.76%（P＜0.01），而ATRA组c-Fos蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）；与ATRA组相比，ATRA+LE540组c-Fos蛋白表达增加55.9%（P＜0.01），组间差异具有统计学意义（F=26.492，P＜0.001，图5B）。

图4 LE540对ATRA干预48 h后ARPE-19细胞中RARβ和c-Fos基因表达的影响Fig.4 Effects of LE540 on RARβ and c-Fos expression in ARPE-19 cells after being treated with ATRA at 48 h

图5 LE540对ATRA干预48 h后ARPE-19细胞中RARβ和c-Fos蛋白表达的影响Fig.5 Effects of LE540 on RARβ and c-Fos expression in ARPE-19 cells after being treated with ATRA at 48 h

2.6 T-5224对ARPE-19细胞内AP-1 DNA结合活性的影响

EMSA结果显示：T-5224干预24 h和48 h后，与对照组相比，细胞内AP-1 DNA结合活性分别减少43.28%和63.05%（P＜0.01），组间差异具有统计学意义（F=58.798，P ＜0.001，图6）。

图6 T-5224对ARPE-19细胞内AP-1 DNA结合活性的影响Fig.6 Effect of T-5224 on AP-1 DNA Binding Activity in ARPE-19 Cells

2.7 ATRA和T-5224对ARPR-19细胞表达和分泌TGF-β2的影响

Western blot结果显示：ATRA组与对照组相比，TGF-β2表达增加64.04%（P＜0.01）；ATRA+LE540和ATRA+T-5224组与ATRA组相比，TGF-β2表达分别减少19.59%和19.34%（P＜0.05），组间差异具有统计学意义（F=24.527，P＜0.001，图7A）。ELISA结果显示：ATRA组［（1142±96）pg/mL］对照组［（894±56）pg/mL］相比，TGF-β2分泌增加27.74%（P＜0.01），ATRA+LE540 组［（963±60）pg/mL］和ATRA+T-5224组［（1047±72）pg/mL］与ATRA组相比，TGF-β2分泌分别减少19.75%和18.9%（P＜0.05），组间差异具有统计学意义（F=10.273，P ＜0.01，图7B）。

3 讨论

近视发生的“视网膜局部调控学说”［6-7］认为，视网膜感知异常视觉信号（如形觉剥夺［8］）后，释放与近视有关的一级信号因子及二级信号因子，经视网膜色素上皮层-脉络膜信号转导后，作用于巩膜，引起巩膜主动塑形，最终导致轴性近视发生。RA和TGF-β2是目前研究较多的近视相关因子，RA是维生素A在体内的自然衍生物，在眼部起作用的主要是ATRA，生物活性主要由视黄酸受体β（retinoic acid receptor β，RARβ）介导。在实验性近视动物模型中（如FDM）中，RA和RARβ的表达均升高，给豚鼠喂食RA可以使眼轴加速延长，屈光状态向近视方向发展［9-10］。研究表明，RA与RARβ结合后诱导RPE分泌TGF-β2，而TGF-β2［11-12］参与调控细胞外基质的合成和分泌，而后者正是引起巩膜主动塑形、眼轴延长的重要基础。

在实验性近视动物模型中，AP-1复合物的亚单位之一的c-Fos表达下降［13］，而肿瘤学领域的研究提示，RAR与AP-1有密切的联系［14］。由此可见，RA、AP-1和TGF-β2都是与近视密切相关的活性因子，而且它们之间也存在千丝万缕的联系，本研究通过体外实验探讨上述因子的上下游调控关系。

结果显示：ATRA干预24 h后RARβ的表达水平明显升高，提示RA作为上游信号因子与RPE上的RARβ结合发挥作用，RARβ是ATRA作用于ARPE-19细胞内信号通路中靶分子之一，与文献报道［15］一致。c-Fos的表达先升后降，提示随着干预时间的延长，RA促进RARβ的表达而抑制c-Fos的表达。既往报道的实验性近视动物模型中，c-Fos的表达是下降的，而本实验观察到c-Fos的表达出现先上升后下降的情况。分析其原因如下：c-Fos属于早反应基因［16］，在细胞内能快速灵敏地对外界刺激（如ATRA干预）作出反应，本实验在ATRA干预6 h和12 h时检测到c-Fos表达升高，很可能是一过性的反应性升高，后随着时间延长而受到抑制。而既往报道的实验性动物模型近视造模长达12 w，很可能未捕捉到c-Fos的早期变化。

图7 T-5224对ATRA干预后ARPE-19细胞中表达和分泌TGF-β2的影响Fig.7 Effects of T-5224 on TGF-β2 expression in ARPE-19 cells after being treated with ATRA

为了探究RA、AP-1和TGF-β2之间的联系，本实验首先用RARβ阻断剂抑制RARβ的活性，结果显示RARβ的表达下调而c-Fos的表达上调，说明阻断RARβ能抑制RA诱导的RARβ上调；且RARβ被阻断后，ATRA对c-Fos表达的抑制效应减弱，提示ATRA通过RARβ来进一步影响c-Fos的表达。那么AP-1和TGF-β2之间的联系又是怎么样的呢，考虑到AP-1是由c-Fos和c-Jun两个亚单位组成，本研究采用EMSA法检测AP-1复合物DNA与蛋白的结合活性，观察AP-1阻断剂T-5224的最佳作用时间。结果显示，ATRA能促进TGF-β2的表达和分泌，而阻断RARβ和AP-1后，ATRA对TGF-β2的诱导表达作用亦受到抑制，说明ATRA通过RARβ影响AP-1的转录活性（如抑制亚单位c-Fos的表达），进而促进ARPE-19细胞分泌TGF-β2。

综上所述，本研究初步阐明了上调及下调RA信号以及改变AP-1转录活性对RPE分泌TGF-β2的影响及可能的作用途径。目前本研究只在细胞水平上对近视相关因子RA、AP-1和TGF-β2之间的联系进行研究，下一步我们将继续在近视动物模型上进行体内实验，进一步求证以上因子与近视发生发展的相关性。