增强型体外反搏对稳定性劳累型心绞痛外周血单个核细胞损伤的影响

谢天鸽，谢天飞，刘 云，段继豪

稳定性心绞痛(stable angina pectoris，SAP)是冠状动脉血流量不足所致的心肌缺血，导致胸部及附近部位的不适，可伴心功能障碍，但没有心肌坏死。临床上常表现为经胸骨或胸骨后压力或窒息感或疼痛，并伴有疲倦，对患者的健康和生活质量产生影响[1]。目前临床治疗主要是预防心肌梗死和猝死，延长生存期，缓解缺血症状，提高生活质量。增强型体外反搏(enhanced external counterpulsation，EECP)治疗冠状动脉疾病为一种有效无创治疗，可通过提高主动脉舒张压，增加心脏输出量增，提高静脉回流[2]。EECP还可以改善ST段的心绞痛[3]，而且已有文献报道了EECP长期治疗后所产生的持续功效[4]。但其具体发挥临床作用的机制并不是太明确，本研究通过分析体外反搏对稳定性劳累型心绞痛患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)活性及其炎症的影响，旨在探讨其临床疗效和机制，为临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015年1月至2018年1月在河南省漯河市第三人民医院心血管内科接受治疗的484例稳定性劳累型心绞痛患者作为研究对象，所有患者依据随机数字表法分成观察组和对照组：观察组243例，其中男性151例，女性92例；年龄60～84(66.24±10.23)岁。对照组241例，其中男性155例，女性86例；年龄60～84(67.55±10.32)岁。两组患者的性别、年龄、基础疾病、用药情况等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，实验方案经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。见表1。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：①符合国际心脏病学会及WHO提出的缺血心脏病的诊断标准[5]。②均经临床、影像学等检查确诊。③年龄均≥60岁。排除标准：①合并恶性肿瘤等终末期疾病和自身免疫性疾病的患者；②合并活动性感染疾病的患者。

1.3 方法对照组入院后按照病情接受β-阻滞剂、钙阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、硝酸盐、降脂药/阿司匹林/抗血小板药、PCI等常规治疗。观察组在常规治疗的基础上，采用加强型体外反搏器体外反搏治疗，每天1 h，每周6 d，连续6周。反搏气囊充气压力0.35～0.40 kg·cm-2。治疗时严格按照说明书进行操作，执行部件主要包括三副充气囊套，分别包扎于小腿、大腿及臀部。在心电R波的触发下，气囊自小腿、大腿、臀部自下而上序贯充气，在心脏舒张期加速回流，改善心、脑等重要脏器血流灌注；在心脏收缩期，三副充气囊则同时排气，使心脏射血的阻力降低。

表1 两组患者一般资料比较 例(%)

1.4 临床疗效评价治疗结束后，参考加拿大分级(Canadian Cardiovascular Society,CCS)标准，其中心绞痛至少改善>1级为有效，运动耐量主要参考患者主诉来确定有效性，以爬楼增加一层或平路行走增加50 m判断运动耐量增加[6]。

1.5 样本采集及外周血单个核细胞分离、培养治疗后，患者均采集空腹静脉血10 mL，取5 mL空腹静脉血肝素抗凝3 000 r·min-1离心5 min，应用人淋巴细胞分离液分离PBMC，分成2份，其中1份调整细胞密度为1×106个·mL-1，并接种于24孔板，加入脂多糖终浓度为10 mg·L-1的培养液，37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，另设置只加培养液培养的细胞，收集细胞培养液及细胞，备用。取5 mL空腹静脉血3 000 r·min-1离心5 min，分离血清，-20 ℃冰箱冻存备用。

1.6 观察指标采用ELISA法检测血清和细胞液中白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、IL-1β水平，试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号20170214、20170326、20170219)，按照说明书进行操作。

1.7 FQ-PCR检测TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA的表达所有的PBMC采用Trizol提取RNA，测定纯度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录生成cDNA。PCR采用20 μL的反应体系，其中2×SYBRR Premix Ex-TaqⅡ10 μL，上游(10 μmol)和下游(10 μmol)各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR级高纯水8 μL。采用light cycleR 96实时荧光定量PCR仪(Roche Diagnostics 公司，德国)同时对目的基因和内参基因(β-actin)进行基因扩增，引物序列由上海英骏公司提供。TLR4上游序列：5’-CTTGGCGCTGTCTCTCCC-3’，下游序列：5’-AGGCGTGATTCTTCCCACAG，产物481 bp；MyD88 (NM_002468.4)上游序列：5’-GCTCATCGAAAAGAGGTGCC-3’，下游序列：5’-GGTTGGTGTAGTCGCAGACA-3’，产物206 bp；NF-κBp65上游序列：5’-GGCAGGAAGAGGAGGTTTCG-3’，下游序列：5’-TGAAGGTATGGGCCATCTGC-3’，产物554 bp；β-actin(NM_001101.4)上游序列：5’-GCCCTATAAAACCCAGCGGC-3’，下游序列：5’-TCGATGGGGTACTTCAGGGT-3’，产物332 bp。采用相对定量2-△△Ct法比较目的基因水平。

3 结果

3.1 两组临床疗效及症状改善对比观察组临床总有效率明显优于对照组(P<0.05)，并且心绞痛缓解、运动耐量增加的例数明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 临床疗效比较 例(%)

3.2 血清中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平比较与对照组比较，血清中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 血清IL-6、Hs-CRP、IL-1β比较 ng·L-1

3.3 脂多糖刺激的PBMC培养液中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平比较与对照组比较，培养液中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 培养液IL-6、Hs-CRP、IL-1β比较 ng·L-1

3.4 未接受脂多糖刺激的PBMC中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平与对照组比较，观察组外周血单个核细胞中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平

3.5 脂多糖刺激的PBMC中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平与对照组比较，观察组外周血单个核细胞在脂多糖刺激后TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 脂多糖刺激后TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平

3 讨论

EECP为一种非侵入性技术，用于治疗不适合常规冠脉血管重建术的难治性患者， 而且已有文献证明EECP可减少患有稳定型心绞痛患者的运动诱发的局部缺血时间[7]。另外，还能减少严重左心室功能不全(射血分数≤35%)患者的心绞痛发作并改善生活质量，并且这些改善可持续5 a[8]。单核巨噬细胞为动脉粥样硬化斑块的成分，脂多糖与单核细胞脂多糖受体结合后，诱导单核细胞合成炎性细胞因子、黏附分子等[9]。本研究中，对照组患者的血清中IL-6、Hs-CRP、IL-1β维持较高水平，且受脂多糖刺激后，IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平升高更加显著，均明显高于观察组，这也说明增强的体外反搏可能抑制了外周血单个核细胞的活性。然而，迄今为止，研究尚未阐明EECP治疗心血管疾病的作用机制和总体疗效。

研究表明，EECP的每个阶段可以被认为是通过增加脉动和振荡流动，并提供直接剂量的血管药物，从而对内皮提供改善其功能的“按摩”形式[10]。文献显示，稳定心绞痛患者常伴有较高水平的氧自由基，且自由基清除酶活性较低，从而导致患者出现氧自由基生成增多及脂质过氧化堆积，并加速冠状动脉痉挛和冠状动脉硬化进展，而冠状动脉痉挛和冠状动脉硬化可导致患者产生缺血—再灌注损伤，并导致血管内的促炎反应[11]。本研究针对稳定性劳累型心绞痛患者进行了增强型体外反搏治疗，结果显示观察组患者的血清IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平明显低于对照组，提示EECP降低了机体的炎症反应。本研究还发现，血清IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平与脂多糖刺激分泌的IL-6、Hs-CRP、IL-1β显著相关，表明增强型体外反搏可能触发了血管内皮细胞的自我调节和自我修复功能，改善了器官和组织的血液灌注，从而改变血管内皮细胞供氧水平和代谢能力[10]，减少炎症介质的分泌，减少炎症损伤。

已有文献显示，稳定性劳累型心绞痛患者伴有高水平的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[12]，而高水平的ROS会促进IKB的释放和NF-κB的核转位，并通过对NF-κB亚基的修饰以及NF-κB转录活性的转录辅助因子的修饰调节NF-κB的转录活性。而TLR4属于TLR家族蛋白，能通过激活Toll样受体信号通路中的接头分子MyD88，传递上游信息并激活NF-κB等信号通路，级联放大炎症反应，诱导血管损伤。高水平的ROS可以直接或间接激活TLR4/NF-κB信号通路级联反应，增加炎性因子表达水平，促进机体的炎症反应[13]。本研究中，观察组患者PBMC的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平明显降低。而PBMC接受脂多糖刺激后，TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平整体增加，但与对照组比较，仍然呈现较低水平，这也验证了EECP对TLR4/NF-κB信号通路的影响，通过抑制TLR4活性，减弱传递到NF-κB的炎症信号，降低MyD88、NF-κB的表达水平，并反馈抑制外周血单个核细胞分泌IL-6、Hs-CRP、IL-1β。

总之，EECP可通过调节稳定性劳累型心绞痛患者炎症水平，减少机体损伤，其机制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关，从而达到临床治疗的目的。