试剂盒联合硅胶膜法提取陈旧性骨骼和牙齿DNA

张 科，周小强

骨骼和牙齿是法医DNA检验中常见的生物检材，其DNA检验结果对于身源查找可能是唯一的识别依据。骨组织内的细胞由于被钙化的细胞外基质所保护，即使面对各种外界环境也可以得到长期有效的保存，这是检验的基础，但这也大大增加了提取难度。在这类检材的提取方法研究中，先后出现了CTAB法[1]、硅珠法[2]、压力循环仪法[3]等，但这些方法需要EDTA长时间脱钙或纯化，操作步骤相对繁琐，提取难度较大，同时也因操作环节繁琐，提高了样品污染的概率。如何从中获得高质量的DNA模板和满意的STR分型，是法医物证检验鉴定工作必须正视的挑战。利用PrepFiler Express BTATM试剂盒结合Automate ExpressTM自动化法医提取系统对骨骼牙齿的提取已有报道[4]，其裂解能力、提取效率、获得模板的质和量较其他提取方法有较大的优势。本研究通过PrepFiler Express BTATM试剂盒联合硅胶膜法建立陈旧性骨骼牙齿DNA检材的提取方法，旨在实际工作中充分拓展该试剂盒的应用。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 样本来源选取骨骼10份(依次编为1～10号)，牙齿10份(依次编为11～20号)，均来自于日常检案收集的不同个体样本。上述样本经骨骼孵育液联合硅珠法或利用PrepFiler Express BTATM试剂盒结合Automate ExpressTM自动化法医提取系统均获得良好分型，以为对照。

1.2 主要仪器与试剂电钻、砸牙器(公安部物证鉴定中心)；24孔1.5 mL恒温混匀仪(Eppendorf公司，德国)；QIAcube全自动化核酸纯化仪(QIAGEN公司，德国)；9700型PCR扩增仪，3500XL型基因分析仪(Life Technologies公司，美国)；PrepFiler Express BTATM试剂盒(采用其中的裂解液、蛋白酶K，LysepTM柱及裂解管)，QIAamp DNA Investigator kit(QIAGEN公司，德国)，GolbalFiler试剂盒(Life Technologies公司，美国)。

1.3 方法

1.3.1 样本处理刮去待检骨骼样本表层垢物并清水洗净表面，再用无水乙醇冲洗并拭干，做好标记，紫外灯下各面均照射15 min以上。低转速钻取选定部位，收集100 mg左右的骨粉置于PrepFiler裂解管内。选择牙根、牙冠完整无损的牙齿，刮去表层并清水洗净表面，放入干净的小烧杯内，加入5%的次氯酸钠溶液浸泡约15 min后取出，用水冲洗1 min，再用无水乙醇冲洗并拭干，做好标记，紫外灯下照射15 min以上。砸断牙齿根部，砸成粉末，收集100 mg左右的牙粉置于PrepFiler裂解管内。

1.3.2 DNA的提取将20个实验样本分别加入PrepFile裂解液300 μL、PK10 μL(1 mol·L-1)、DTT10 μL(10 mg·mL-1)，振荡混匀后放置在24孔1.5 mL恒温混匀仪上1 200 r·min-1消化2 h，快速离心，尽量多地吸取其上清至1.5 mL收集管上的LysepTM柱内，12 000 g离心1 min，弃掉滤柱。至此步骤，将上述实验样本按照QIAcube全自动化核酸纯化仪操作手册提取检材DNA，模板DNA终体积为60 μL备检。

1.3.3 DNA的扩增及电泳检测将上述20个实验样本采用GolbalFiler试剂盒进行扩增，扩增体系10 μL，其中Mix 3 μL，Primer 1 μL，模板DNA均为6 μL，扩增循环次数增加至30 cycles(循环参数视后期检验情况进行调整，其他扩增参数同试剂盒说明书)。上述扩增产物均以3500XL型基因分析仪进行电泳分离和激光扫描分析，使用GeneMapper®ID-X软件进行数据分析，获得各样本STR基因分型。

2 结果

对20个研究样本的DNA检验结果进行初步分析(RFU≥100，Filter：10%)，以基因座上分型相同为检出标准，排除因可能的DNA浓度过低所致优势扩增和无效扩增结果。统计得出实验样本检出基因座数量，见表1。从检验结果来看，通过PrepFiler Express BTATM试剂盒联合硅胶膜法[5]对陈旧性骨骼牙齿DNA检材获得了相对满意的效果，利用GolbalFiler试剂盒检出13个完整基因分型的占80%。从分析图谱来看，未能检出的基因座往往集中于D16S539、D2S1338、D18S51等较大片段。同对照样本相比，30个扩增循环数的条件下，经该方法检验获得的峰值普遍较低。

表1 文中提取方法检出基因座数量情况

3 讨论

PrepFiler Express BTATM试剂盒往往同Automate ExpressTM自动化法医提取系统协同使用，同其他方法相比有着多方面显著的优势[6]，其中BTA试剂盒的裂解能力、裂解效率和其中提供的特殊构造的纳米级磁珠是其亮点。本研究中的实验更倾向于利用BTA试剂盒的裂解能力和裂解效率以获得较多的DNA，且前期消化裂解的过程减少了很多繁复的步骤，消除了因脱钙可能造成的DNA损失[7]，然后通过QIAcube核酸提取仪对裂解获得的DNA进行纯化[8]和浓缩[9]。本研究实验获得了较为满意的结果，由此表明通过实验试图建立的方法可以为陈旧性骨骼牙齿类检材的提取提供思路，对于没有购置Automate ExpressTM自动化法医提取系统的实验室，可利用该方法手工或开展陈旧性骨骼牙齿类检材的检验工作。

从20份实验样本的结果分析来看，经该方法检验获得的峰值普遍较低，3份骨骼样本和1份牙齿样本未得到满意的基因分型结果，提示此方法实验流程还需进一步优化，以获取更高质量、更多数量的DNA。考虑产生这一问题的原因可能有：①两种试剂盒所包含的试剂之间有不兼容的情况存在，影响了提取效率；②未检出的骨骼牙齿样本本身条件极差，其中就有2份骨骼长期暴露于潮湿环境中，骨松质及髓腔已高度腐败，2份牙齿牙根处裂开，牙髓腔内变色。③扩增参数、扩增体系、适度增加Taq酶、增加引物、PCR后纯化等方式进行调整以提高检出率还没有进一步的研究和实验。实验过程提示：始终不能忽视骨骼牙齿类检材检验的复杂性，由于该类检材提取的DNA浓度较低，经常会发生丢峰或非特异性扩增情况出现。如果没有对照样本，仍建议通过多点取样、平行试验、互为对照的方式，以保证检验结果的准确性。

作者试图建立通过PrepFiler Express BTATM试剂盒联合硅胶膜法提取人体陈旧性骨骼牙齿DNA的研究还存在一定的局限性，对陈旧和腐败样本的研究还需大量实践总结；未对该方法和其他常用方法提取的DNA进行定量研究和对照；操作步骤和细节还未进行精细化固定。但就实验结果来看，该方法的提取效率能够满足DNA实验室的常规需求，并作为其他方法的有效补充。