HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

2019-08-16 07:43王敏敏魏建宏任来峰
天津医药 2019年7期
关键词:质粒测序载体

王敏敏,魏建宏,任来峰

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要风险因素[1],而HCC是最为难治的恶性肿瘤之一,也是我国位居第二的癌症“杀手”,HCV感染约与20%的HCC相关[2]。HCV核心蛋白(Core蛋白)除了参与病毒组装外,还能与正常细胞蛋白相互作用,扰乱细胞正常的信号转导、转录调控等信号传递[3]。HCV Core蛋白被认为是HCV相关HCC的潜在癌基因或辅因子[4-5],有研究表明,过表达HCV Core后,在其转基因(TG)小鼠中可以诱导肝癌的形成[6]。

自噬是一种利用溶酶体将自身细胞内受损、变性或衰老的蛋白以及细胞器消化降解的过程,并参与细胞多种生理及病理过程调控[7],细胞自噬与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明,HCV Core蛋白可诱导肝细胞自噬[8-9]],而 Hara等[10]研究显示,HCV Core蛋白可抑制HCV感染时的有丝分裂;有研究认为,这种抑制可导致线粒体泛素化、有丝分裂体形成和自噬降解的失败[11]。有关HCV Core蛋白与自噬的关系研究尚不多,其具体机制仍有待阐明。因此,本研究拟通过在HeLa细胞中表达外源HCV Core蛋白,研究其对HeLa细胞自噬的影响,为进一步阐明HCV相关的HCC的发病机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 主要材料 PLVX-IRES-ZsGreen1过表达质粒和HCV复制子质粒(pJFH1)为本实验室保存,大肠埃希菌感受态细胞DH5α购自索莱宝生物技术公司,人宫颈癌HeLa细胞株购自丰晖生物技术公司,In-Fusion®HD Cloning Kit购自Clontech公司,凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自Omega公司。限制性内切酶XhoⅠ购自北京百奥莱博科技有限公司,委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成及DNA测序;DNA转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司,核染料DAPI购自Vector公司,抗HCV Core抗体购自博奥森公司,实验所用FITC标记的二抗(抗鼠)和内参α-tubµlin抗体以及Cyc3标记的二抗(抗兔)均购自Sigma公司,抗LC3B抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 载体的构建 (1)目的基因扩增:按照同源重组原理设计Core基因引物,上游5′-CGGTGAATTCCTCGAATGAGCACAAATCCTAAACC-3′,下游 5′-TAGAACTAGTCTCGATCAAGCAGAGACCGGAACGGT-3′。以 pJFH1为模板进行PCR扩增,反应体系为:上、下游引物各1µL,pJFH1模板0.5µL,Taq DNA聚合酶0.5µL,dNTP混合液0.5µL,PCR Buffer 2.5µL,ddH2O 19µL。反应条件:95℃预变性3 min;95℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 150 s,共34个循环;72 ℃ 5 min充分延伸。PCR产物分离并纯化,4℃保存备用。(2)重组载体克隆:XhoⅠ限制性内切酶切割空载体PLVX-IRES-ZsGreen1使之线性化,并用凝胶回收试剂盒回收纯化;用IN-fusion cloning kit将

HCV Core基因片段与线性化载体进行重组;将重组质粒转化到含氨苄青霉素(Amp)LB培养平板,于37℃培养12 h;挑取LB转化板上的阳性菌落,接种于15 mL(含Amp)LB液体培养基中,置于37℃摇床培养18 h(180 r/min)。次日按说明书提取质粒,选用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒PLVXIRES-ZsGreen1-Core,并送博奥公司测序证实。

1.2.2 细胞的传代与培养 用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清和1%双抗)在37℃、5%CO2孵箱中培养宫颈癌HeLa细胞,每隔1~2 d更换新鲜培养基,待细胞长至汇合度达85%~90%时,用胰酶消化进行传代培养。

1.2.3 质粒转染 选取对数生长期的HeLa细胞接种于无菌24孔细胞培养板中,常规培养待细胞贴壁生长至约50%~60%汇合度时进行细胞转染,设PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒的空白对照组,采用Lipofectamine 2000按试剂说明书进行操作。转染完成6~8 h后换常规DMEM高糖培养基并于48~72 h后进行后续实验。

1.2.4 免疫印迹(Western Blot)检测Core蛋白以及LC3蛋白的表达 参照文献[12]:转染48 h后,弃去24孔板中的培养基并用预冷的PBS清洗1次,经RIPA裂解液裂解后收集各组细胞并抽提细胞总蛋白,经BCA蛋白定量试剂盒定量并调整蛋白浓度,按说明书加入5×loading buffer煮沸后得到蛋白样品。总蛋白经12%SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h(摇床),分别用抗HCV Core(1∶100)、LC3B(1∶1 000)、α-tubµlin(1∶5 000)抗体4 ℃孵育过夜,TBST漂洗;再用HRP标记的抗兔和抗鼠二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h,TBST漂洗,将膜用ECL显色,Fluor Chem FC2成像仪曝光并分析结果,实验重复3次。

1.2.5 免疫荧光(IF)检测LC3水平 参照文献[13]:HeLa细胞接种到24孔板中的细胞爬片上并转染相应质粒48 h后直接收样;PBS洗涤1次,4%多聚甲醛室温固定10 min,PBS漂洗后;用0.3%Triton X-100室温通透10 min,PBS漂洗;用免疫荧光封闭液(0.1%Triton X-100+1%BSA)室温封闭30 min以上,加入抗LC3B或抗Core抗体37℃湿盒中孵育30 min,用PBS洗3次;37℃湿盒中孵育荧光素标记的抗兔或抗鼠二抗30 min,PBS洗3次;DAPI封片,荧光显微镜拍片记录结果,实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,符合正态分布的计量数据以均数±标准差(±s)表示,2组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒的构建及鉴定 重组载体用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切结果显示,酶切后的重组质粒为2个条带,大小分别与空载体PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因Core近似,见图1A。测序结果示,与标准序列比对,重组质粒PLVX-IRES-ZsGreen1-Core序列完全正确,见图1B。

Fig.1 Core-Green digested with EcoRⅠand BamHⅠ图1 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒的鉴定

2.2 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒在HeLa细胞中的表达 只有PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞可表达HCV Core蛋白,而PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染组和未转染质粒空白对照组的无蛋白表达,且与Core蛋白的相对分子质量符合,见图2。

Fig.2 Expression of HCV Core protein in HeLa cells图2 HCV Core蛋白在Hela细胞中的表达

2.3 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒诱导HeLa细胞自噬 LVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞LC3Ⅱ水平(1.069±0.049)高于PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组(0.776±0.047),差异有统计学意义(t=7.433,P<0.05),见图3。免疫荧光染色结果显示,与Western Blot结果一致,HCV Core蛋白高表达的细胞(绿色荧光)LC3焦点明显增多,且主要分布于细胞质中,见图4。

Fig.3 Expression of LC3 detected by Western Blot assay图3 Western Blot法检测LC3蛋白表达

3 讨论

基因克隆是分子生物学的基本技术,与传统的基于双酶切的分子克隆技术比较,近年来发展起来的基于同源重组的分子克隆技术(又称为无缝克隆),具有简便、快速、高效和适用范围广等优点[14]。本实验运用同源重组克隆方法构建了PLVX-IRESZsGreen1-Core真核表达载体,并经双酶切和基因测序证实,重组DNA序列正确,重组质粒转染人宫颈癌HeLa细胞后可表达HCV Core蛋白,这些结果证实已成功构建了HCV Core真核表达载体。

Fig.4 The changes of LC3 punctuates induced by HCV Core(×1 000)图4 HCV Core蛋白诱导的LC3焦点变化(×1 000)

研究表明,HCV Core蛋白是诱导肝癌发生的最重要蛋白之一[15],可通过干扰宿主细胞多条信号通路诱导细胞转化[16],但其具体致癌细节仍需进一步研究。自噬是细胞适应环境变化的一种生理病理过程,以细胞质内出现自噬体为特征,也是吞噬降解细胞内部分受损细胞器或变性蛋白的过程[17]。在自噬发生时,微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein1 light chain3,LC3)定位于前自噬体和自噬体表面,参与自噬体的整个形成过程,LC3有Ⅰ型和Ⅱ型,自噬发生时伴随着LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化,因此,该转化过程成为评价细胞自噬的重要参考[18-19]。自噬与肿瘤的发生发展密切相关,Liu等[20]研究表明,HCV Core蛋白可诱导肝QSG-7701细胞自噬,并伴随着LC3Ⅱ升高;Wang等[21]在肝癌细胞Huh7中的研究表明,HCV Core蛋白通过EIF2AK3和ATF6促进细胞自噬;而Hara等[10]研究则显示,HCV Core蛋白可抑制细胞线粒体自噬。本研究中,Western Blot结果显示,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组自噬标记分子LC3Ⅱ表达增加,免疫荧光结果显示LC3Ⅱ荧光焦点增多,证实HCV Core蛋白可提高HeLa细胞自噬水平。另有研究表明,HCV诱导细胞自噬对病毒自身的复制至关重要[22],同时细胞自噬信号的扰乱势必干扰细胞正常生理过程,可能是其引起细胞恶性转化的促进因素,但具体细节仍待进一步研究。

综上所述,本研究用无缝克隆方法构建PLVXIRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并可在转染的HeLa细胞中诱导细胞自噬,为进一步探索HCV Core蛋白干扰宿主细胞功能奠定了一定的基础。

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