病理状态对心肌细胞及心脏成纤维细胞β3-肾上腺素受体表达的影响

徐忠诚，辛俊舟，吴磊，刘红阳，王丽△

心力衰竭的重要病理特征是交感-肾上腺素系统过度激活，其表现为血浆儿茶酚胺水平增加和交感神经持续激活。β-肾上腺素受体（β-adrenergic receptor，β-AR）作为典型的心脏肾上腺素受体，在代偿性心脏重塑中介导交感神经激活引起正性肌力作用，并在失代偿性心脏重构的进展中起重要作用。β3-肾上腺素受体（β3-adrenergic receptor，β3-AR）是β-AR的一种亚型受体，与β1-AR、β2-AR同属于具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体，并参与心力衰竭的病理生理过程。在心力衰竭过程中，β1-AR在持续激活后发生显著“减敏”和下调；β2-AR虽然在蛋白水平保持不变，但其所依赖的传导信号从Gs转变成Gi途径［1］。与之相反，β3-AR由于缺乏蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）和G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRK）的磷酸化位点而不易发生受体“减敏”现象，从而在心力衰竭时持续发挥作用［2-3］。

与β1-AR、β2-AR在心脏中的作用不同，β3-AR在心脏中主要与Gi蛋白相偶联，并通过NO合成酶/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G（NOS/cGMP/PKG）途径引起负性肌力作用，并且随着心力衰竭的不断加重，负性肌力作用逐渐增强［4-5］。已有研究表明，在心力衰竭大鼠模型和临床患者的心脏组织中β3-AR表达均明显增加［6-7］。在快速心房起搏引起心房颤动的家兔心力衰竭模型中，β3-AR表达也明显增加［8］。但是，心力衰竭时心肌组织的β3-AR表达增加主要来自心肌细胞还是心脏成纤维细胞尚不清楚。为此，本研究分离培养Sprague-Dawley（SD）乳鼠原代心肌细胞和心脏成纤维细胞，模拟参与心力衰竭发生发展的两个主要病理系统的激活，分别给予血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）及去甲肾上腺素（Noradrenaline，NE）进行刺激，然后检测这两种细胞中β3-AR mRNA的表达变化，以此判断病理刺激对心肌细胞和心脏成纤维细胞β3-AR表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 出生1～3日龄的SPF级SD乳鼠，由北京大学医学部实验动物中心提供，动物伦理批准号为：LA2010-035。胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、高糖达氏改良伊格尔（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）培养基、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，双联抗生素（青霉素、链霉素）购自美国HyClone公司，牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）、40 g/L多聚甲醛、Triton X-100、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyuridine，Brdu）、AngⅡ、NE和小鼠抗辅肌动蛋白（α-actinin）单克隆抗体购自美国Sigma公司，兔抗波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体购自美国CST公司，Alexa Fluor®594标记的驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor®488标记的驴抗兔IgG、hoechst33342染色液、TRIzol购自美国Invitrogen公司，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、Hank’s平衡盐溶液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS）、逆转录及PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司，实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）引物序列均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞分离与培养 将10只1～3日龄的SD乳鼠用75%的乙醇浸泡消毒后，立即于超净工作台中开胸取出心脏，置于盛有预冷PBS的玻璃皿中清洗2次。剔除心耳和大血管等组织，用小镊子将心脏移到10 mL的消化瓶中，用小剪刀快速剪碎心室成小块，滴加适量PBS洗去残血。加入用HBSS配制的消化液（含0.07%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型胶原酶）进行消化。整个消化过程在37℃恒温搅拌条件下进行，每消化4 min后吸取消化瓶中的上清液，加入到等量含10%FBS的DMEM培养液中，轻轻吹打混合均匀。重复该过程约7～8次直到组织块消化完全，将收集的细胞悬液于室温离心6 min，离心时重力加速度为9×g，弃上清，用含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞，合并每次所得细胞悬液，接种于直径10 cm的培养皿中，在37℃、5%CO2的培养箱内静置2 h使心脏成纤维细胞完全贴壁。然后吸取培养皿中的培养液至80 mL的烧杯中，根据实验需求稀释至相应体积，再按1∶100的比例加入Brdu，轻轻吹打混匀后接种到相应的培养板中，待心肌细胞贴壁及心脏成纤维细胞传至第1代时即可进行后续实验。

1.3 免疫荧光鉴定SD乳鼠心肌细胞（Neonatal rat cardiomyocytes，NRCM）和SD乳鼠心脏成纤维细胞（Neonatal rat cardiac fibroblast，NRCF） 将原代心肌细胞以3×105/mL的密度接种于3.5 cm的培养皿中，待细胞完全贴壁后用PBS清洗3次；多聚甲醛（40 g/L）室温固定细胞15 min，PBS清洗残余固定液；0.25%Triton X-100透化各组细胞30 min；用含4%BSA溶液于室温封闭30 min；弃去封闭液后加入小鼠抗α-actinin抗体并放入湿盒4℃孵育过夜；第2天加入Alexa Fluor®594标记的驴抗小鼠IgG荧光二抗避光室温孵育1 h，然后加入DNA染料hoechst染核5 min，于倒置荧光显微镜下观察显色程度并拍照记录，心肌细胞免疫荧光阳性结果为肌丝呈红色。心脏成纤维细胞的免疫荧光鉴定一抗用兔抗Vimentin单克隆抗体，二抗加入Alexa Fluor®488标记的驴抗兔IgG，具体操作方法同上，其阳性结果为细胞骨架呈绿色。

1.4 细胞分组与处理 NRCM和NRCF均设对照组和处理组，对照组正常培养，不作处理；处理组分别用AngⅡ（AngⅡ组，10-6mol/L）来模拟肾素-血管紧张素系统（reninangiotensin system，RAS）激活状态，用NE（NE组，10-5mol/L）来模拟交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）过度兴奋状态。48 h后，分别收集各组细胞进行后续实验。每次实验独立重复6次。

1.5 qPCR检测心肌细胞肥大相关基因、心脏成纤维细胞纤维化相关基因及β3-AR的mRNA表达 用TRIzol提取NRCM及NRCF的总RNA。按照逆转录试剂盒的说明将已提取的RNA（1µg/样品）逆转录成cDNA，再进行qPCR操作。扩增条件为95℃ 5 min预变性；94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，设置40个循环。用GAPDH做为内参，采用2-ΔΔCt法比较目的基因的表达差异。引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequences used in qPCR analysis表1 qPCR所用的引物序列

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism7.0和SPSS 24.0进行作图和统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验或校正t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的形态鉴定及基础状态下β3-AR的表达 刚分离的NRCM呈圆形或椭圆形，悬浮于培养液中，2 h时开始贴壁，24 h时可见存活的细胞完全贴壁；呈星型、梭形、多边形等多种形态；镜下可见细胞有明显的自发性搏动，搏动频率80～120次/min。48 h时心肌细胞伪足相互交联、聚集成簇。NRCF在30 min时即开始贴壁，至2 h时已基本完全贴壁。无自发性搏动，24 h时细胞形态呈梭形、多边形等形态。胞核较大，胞质透明。NRCF生长迅速，48 h即可铺满培养皿的90%。细胞免疫荧光染色可见NRCM肌丝α-actinin表达阳性，NRCF细胞骨架Vimentin表达阳性，证实NRCM和NRCF分离培养成功，见图1。同时，无论是在正常的NRCM上还是在正常的NRCF上，β3-AR mRNA的表达水平都很低，但NRCM组中β3-AR mRNA的表达水平明显高于NRCF组（0.001 10±0.000 27vs.0.000 10±0.000 04），差异有统计学意义（n=12，t=12.375，P＜0.05）。

2.2 AngⅡ刺激下NRCM肥大相关基因及β3-AR的表达情况 NRCM中AngⅡ组ANP、BNP、β-MHC以及β3-AR mRNA表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01），见表2。

Fig.1 Morphological identification of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts图1 心肌细胞与心脏成纤维细胞的形态鉴定

Tab.2 Expression levels of hypertrophy related genes and β3-AR mRNA in NRCM表2 NRCM中肥大相关基因及β3-AR mRNA的表达水平

2.3 AngⅡ刺激下NRCF表型转化及β3-AR的表达情况 NRCF中AngⅡ组COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。NRCF中AngⅡ组β3-AR mRNA表达水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 NE刺激下NRCM肥大及β3-AR的表达情况 NRCM中NE组ANP、BNP、β-MHC以及β3-AR mRNA表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01），见表4。

2.5 NE刺激下NRCF表型转化及β3-AR的表达情况 NRCF中NE组COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。NE组β3-AR mRNA表达水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

Tab.3 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表3 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表达量（±s）

Tab.3 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表3 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表达量（±s）

＊＊P＜0.01

组别对照组AngⅡ组t n6 6 COL-ⅠmRNA 26.868±3.305 43.597±6.705 5.482＊＊COL-ⅢmRNA 12.520±1.979 35.401±4.538 11.321＊＊β3-AR mRNA 0.000 10±0.000 03 0.000 20±0.000 06 1.936

Tab.4 Expression levels of hypertrophy related genes and β3-AR mRNA in NRCM表4 NRCM中肥大相关基因及β3-AR mRNA的表达水平

Tab.5 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表5 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表达量

3 讨论

本研究结果显示，分离培养的NRCM及NRCF中β3-AR表达量均很低，但两者相比，NRCM中β3-AR的表达量要明显高于NRCF。同时，分别在AngⅡ及NE的诱导下，NRCM肥大相关基因表达增加的同时β3-AR的表达也明显增加；而在同样条件的AngⅡ及NE的诱导下，NRCF虽然发生了表型转化但β3-AR的表达并没有明显变化。由此推测，参与心力衰竭发生发展的病理因素AngⅡ和NE主要引起心肌细胞的β3-AR表达增加，而不是心脏成纤维细胞。

正常心脏组织中β3-AR表达量相对较少，仅占到β-AR的2%～3%左右［9］。同时，由于β3-AR与内源性儿茶酚胺的亲和力较低，在正常生理条件下几乎不发挥活性作用［10-11］。但在心力衰竭时，交感神经系统持续激活，引起儿茶酚胺产生增多［12］。高浓度的儿茶酚胺激活β3-AR并通过环磷酸鸟苷（cGMP）依赖性信号通路增加蛋白激酶G（PKG）的活性而对心脏调节起到负性肌力作用，由于β3-AR在分子结构上的特异性导致其不易发生受体“减敏”现象，因而随着儿茶酚胺的不断增加，其介导负性肌力作用逐渐增强［13］。Rozec等［14］研究表明β3-AR激活后产生的负性肌力作用可以降低心肌收缩力、减少心肌做功和耗氧量，从而抵抗β1-AR、β2-AR过度激活所引起的心脏损伤作用。

然而，也有学者研究发现，通过转基因技术使大鼠心脏过表达人β3-AR后，给予β3-AR特异性的激动剂BRL37344产生正性肌力作用，而这一正性肌力作用是β3-AR与Gs蛋白相偶联并活化腺苷酸环化酶及其下游相关信号所介导的［15］。Mulder等［16］发现β3-AR激动剂奈必诺尔（nebivolol）并不能改善心力衰竭并发房颤患者的心脏功能。同时，本课题组前期研究发现β3-AR激活后可通过TGF-β/Smad信号通路介导心脏纤维化，促进心肌重构[17]。这与Sheng等［18］在用快速起搏诱导心房颤动的犬心力衰竭模型中发现，β3-AR表达上调可导致氧化应激和恶化心脏重构的结果相一致。

上述研究结果的不同可能与样本选择、模型制备及检测方法等条件的不同有关。但是，β3-AR在心力衰竭的心脏中表达上调的结果却是一致的。Moniotte等［7］研究发现心肌梗死患者心脏组织中β3-AR的表达较正常对照组明显升高；Miao等［19］研究发现在主动脉缩窄术所致大鼠心力衰竭的心肌组织中β3-AR表达也明显升高。有研究报道在正常心脏心室肌内膜和外膜β3-AR表达无明显差异，但在心房中的表达高于心室［20］。心力衰竭时，β3-AR表达上调的确切病理生理效应还有争议，亟待进行更加深入、更有针对性的研究来进行明确。

心力衰竭发生的机制主要是神经体液因素的改变，如交感神经系统过度兴奋、肾素-血管紧张素系统激活和细胞因子水平失衡等，其病理生理基础为心脏重塑，主要表现为心肌细胞肥大、心肌间质纤维化和神经体液调节中相关细胞因子的改变。为了更有针对性地检测心力衰竭时β3-AR的表达情况，本研究分离培养NRCM和NRCF，并模拟参与心力衰竭发生发展的两个主要病理系统的激活。结果显示，在AngⅡ所诱导的肾素-血管紧张素系统激活状态，NRCM中β3-AR表达明显增加，而NRCF中β3-AR表达没有明显变化；在NE所诱导的交感神经系统过度兴奋状态，NRCM中β3-AR表达也明显增加，但NRCF中β3-AR表达无明显变化，提示AngⅡ和NE作为参与心力衰竭发生发展的重要病理因素主要引起NRCM中的β3-AR表达，而不是NRCF。因为心肌中NRCF的数量要远多于NRCM，但含有的β3-AR的量却极少，即使是在病理状态下也未见明显增加。这一发现为进一步探讨β3-AR参与心力衰竭病理生理效应的具体作用提供了工作基础，也为β3-AR在心力衰竭中的研究提供新的思路。