病理状态对心肌细胞及心脏成纤维细胞β3-肾上腺素受体表达的影响

2019-08-16 07:43徐忠诚辛俊舟吴磊刘红阳王丽
天津医药 2019年7期
关键词:贴壁纤维细胞肌力

徐忠诚,辛俊舟,吴磊,刘红阳,王丽△

心力衰竭的重要病理特征是交感-肾上腺素系统过度激活,其表现为血浆儿茶酚胺水平增加和交感神经持续激活。β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor,β-AR)作为典型的心脏肾上腺素受体,在代偿性心脏重塑中介导交感神经激活引起正性肌力作用,并在失代偿性心脏重构的进展中起重要作用。β3-肾上腺素受体(β3-adrenergic receptor,β3-AR)是β-AR的一种亚型受体,与β1-AR、β2-AR同属于具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体,并参与心力衰竭的病理生理过程。在心力衰竭过程中,β1-AR在持续激活后发生显著“减敏”和下调;β2-AR虽然在蛋白水平保持不变,但其所依赖的传导信号从Gs转变成Gi途径[1]。与之相反,β3-AR由于缺乏蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)和G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRK)的磷酸化位点而不易发生受体“减敏”现象,从而在心力衰竭时持续发挥作用[2-3]。

与β1-AR、β2-AR在心脏中的作用不同,β3-AR在心脏中主要与Gi蛋白相偶联,并通过NO合成酶/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(NOS/cGMP/PKG)途径引起负性肌力作用,并且随着心力衰竭的不断加重,负性肌力作用逐渐增强[4-5]。已有研究表明,在心力衰竭大鼠模型和临床患者的心脏组织中β3-AR表达均明显增加[6-7]。在快速心房起搏引起心房颤动的家兔心力衰竭模型中,β3-AR表达也明显增加[8]。但是,心力衰竭时心肌组织的β3-AR表达增加主要来自心肌细胞还是心脏成纤维细胞尚不清楚。为此,本研究分离培养Sprague-Dawley(SD)乳鼠原代心肌细胞和心脏成纤维细胞,模拟参与心力衰竭发生发展的两个主要病理系统的激活,分别给予血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)及去甲肾上腺素(Noradrenaline,NE)进行刺激,然后检测这两种细胞中β3-AR mRNA的表达变化,以此判断病理刺激对心肌细胞和心脏成纤维细胞β3-AR表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 出生1~3日龄的SPF级SD乳鼠,由北京大学医学部实验动物中心提供,动物伦理批准号为:LA2010-035。胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、高糖达氏改良伊格尔(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)培养基、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶购自美国Gibco公司,双联抗生素(青霉素、链霉素)购自美国HyClone公司,牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)、40 g/L多聚甲醛、Triton X-100、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,Brdu)、AngⅡ、NE和小鼠抗辅肌动蛋白(α-actinin)单克隆抗体购自美国Sigma公司,兔抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体购自美国CST公司,Alexa Fluor®594标记的驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor®488标记的驴抗兔IgG、hoechst33342染色液、TRIzol购自美国Invitrogen公司,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、Hank’s平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS)、逆转录及PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)引物序列均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成,倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司,实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞分离与培养 将10只1~3日龄的SD乳鼠用75%的乙醇浸泡消毒后,立即于超净工作台中开胸取出心脏,置于盛有预冷PBS的玻璃皿中清洗2次。剔除心耳和大血管等组织,用小镊子将心脏移到10 mL的消化瓶中,用小剪刀快速剪碎心室成小块,滴加适量PBS洗去残血。加入用HBSS配制的消化液(含0.07%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型胶原酶)进行消化。整个消化过程在37℃恒温搅拌条件下进行,每消化4 min后吸取消化瓶中的上清液,加入到等量含10%FBS的DMEM培养液中,轻轻吹打混合均匀。重复该过程约7~8次直到组织块消化完全,将收集的细胞悬液于室温离心6 min,离心时重力加速度为9×g,弃上清,用含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞,合并每次所得细胞悬液,接种于直径10 cm的培养皿中,在37℃、5%CO2的培养箱内静置2 h使心脏成纤维细胞完全贴壁。然后吸取培养皿中的培养液至80 mL的烧杯中,根据实验需求稀释至相应体积,再按1∶100的比例加入Brdu,轻轻吹打混匀后接种到相应的培养板中,待心肌细胞贴壁及心脏成纤维细胞传至第1代时即可进行后续实验。

1.3 免疫荧光鉴定SD乳鼠心肌细胞(Neonatal rat cardiomyocytes,NRCM)和SD乳鼠心脏成纤维细胞(Neonatal rat cardiac fibroblast,NRCF) 将原代心肌细胞以3×105/mL的密度接种于3.5 cm的培养皿中,待细胞完全贴壁后用PBS清洗3次;多聚甲醛(40 g/L)室温固定细胞15 min,PBS清洗残余固定液;0.25%Triton X-100透化各组细胞30 min;用含4%BSA溶液于室温封闭30 min;弃去封闭液后加入小鼠抗α-actinin抗体并放入湿盒4℃孵育过夜;第2天加入Alexa Fluor®594标记的驴抗小鼠IgG荧光二抗避光室温孵育1 h,然后加入DNA染料hoechst染核5 min,于倒置荧光显微镜下观察显色程度并拍照记录,心肌细胞免疫荧光阳性结果为肌丝呈红色。心脏成纤维细胞的免疫荧光鉴定一抗用兔抗Vimentin单克隆抗体,二抗加入Alexa Fluor®488标记的驴抗兔IgG,具体操作方法同上,其阳性结果为细胞骨架呈绿色。

1.4 细胞分组与处理 NRCM和NRCF均设对照组和处理组,对照组正常培养,不作处理;处理组分别用AngⅡ(AngⅡ组,10-6mol/L)来模拟肾素-血管紧张素系统(reninangiotensin system,RAS)激活状态,用NE(NE组,10-5mol/L)来模拟交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)过度兴奋状态。48 h后,分别收集各组细胞进行后续实验。每次实验独立重复6次。

1.5 qPCR检测心肌细胞肥大相关基因、心脏成纤维细胞纤维化相关基因及β3-AR的mRNA表达 用TRIzol提取NRCM及NRCF的总RNA。按照逆转录试剂盒的说明将已提取的RNA(1µg/样品)逆转录成cDNA,再进行qPCR操作。扩增条件为95℃ 5 min预变性;94 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,设置40个循环。用GAPDH做为内参,采用2-ΔΔCt法比较目的基因的表达差异。引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequences used in qPCR analysis表1 qPCR所用的引物序列

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism7.0和SPSS 24.0进行作图和统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用独立样本t检验或校正t检验;不符合正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示,组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的形态鉴定及基础状态下β3-AR的表达 刚分离的NRCM呈圆形或椭圆形,悬浮于培养液中,2 h时开始贴壁,24 h时可见存活的细胞完全贴壁;呈星型、梭形、多边形等多种形态;镜下可见细胞有明显的自发性搏动,搏动频率80~120次/min。48 h时心肌细胞伪足相互交联、聚集成簇。NRCF在30 min时即开始贴壁,至2 h时已基本完全贴壁。无自发性搏动,24 h时细胞形态呈梭形、多边形等形态。胞核较大,胞质透明。NRCF生长迅速,48 h即可铺满培养皿的90%。细胞免疫荧光染色可见NRCM肌丝α-actinin表达阳性,NRCF细胞骨架Vimentin表达阳性,证实NRCM和NRCF分离培养成功,见图1。同时,无论是在正常的NRCM上还是在正常的NRCF上,β3-AR mRNA的表达水平都很低,但NRCM组中β3-AR mRNA的表达水平明显高于NRCF组(0.001 10±0.000 27vs.0.000 10±0.000 04),差异有统计学意义(n=12,t=12.375,P<0.05)。

2.2 AngⅡ刺激下NRCM肥大相关基因及β3-AR的表达情况 NRCM中AngⅡ组ANP、BNP、β-MHC以及β3-AR mRNA表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.01),见表2。

Fig.1 Morphological identification of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts图1 心肌细胞与心脏成纤维细胞的形态鉴定

Tab.2 Expression levels of hypertrophy related genes and β3-AR mRNA in NRCM表2 NRCM中肥大相关基因及β3-AR mRNA的表达水平

2.3 AngⅡ刺激下NRCF表型转化及β3-AR的表达情况 NRCF中AngⅡ组COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.01)。NRCF中AngⅡ组β3-AR mRNA表达水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

2.4 NE刺激下NRCM肥大及β3-AR的表达情况 NRCM中NE组ANP、BNP、β-MHC以及β3-AR mRNA表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.01),见表4。

2.5 NE刺激下NRCF表型转化及β3-AR的表达情况 NRCF中NE组COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.01)。NE组β3-AR mRNA表达水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

Tab.3 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表3 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表达量(±s)

Tab.3 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表3 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表达量(±s)

**P<0.01

组别对照组AngⅡ组t n6 6 COL-ⅠmRNA 26.868±3.305 43.597±6.705 5.482**COL-ⅢmRNA 12.520±1.979 35.401±4.538 11.321**β3-AR mRNA 0.000 10±0.000 03 0.000 20±0.000 06 1.936

Tab.4 Expression levels of hypertrophy related genes and β3-AR mRNA in NRCM表4 NRCM中肥大相关基因及β3-AR mRNA的表达水平

Tab.5 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表5 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表达量

3 讨论

本研究结果显示,分离培养的NRCM及NRCF中β3-AR表达量均很低,但两者相比,NRCM中β3-AR的表达量要明显高于NRCF。同时,分别在AngⅡ及NE的诱导下,NRCM肥大相关基因表达增加的同时β3-AR的表达也明显增加;而在同样条件的AngⅡ及NE的诱导下,NRCF虽然发生了表型转化但β3-AR的表达并没有明显变化。由此推测,参与心力衰竭发生发展的病理因素AngⅡ和NE主要引起心肌细胞的β3-AR表达增加,而不是心脏成纤维细胞。

正常心脏组织中β3-AR表达量相对较少,仅占到β-AR的2%~3%左右[9]。同时,由于β3-AR与内源性儿茶酚胺的亲和力较低,在正常生理条件下几乎不发挥活性作用[10-11]。但在心力衰竭时,交感神经系统持续激活,引起儿茶酚胺产生增多[12]。高浓度的儿茶酚胺激活β3-AR并通过环磷酸鸟苷(cGMP)依赖性信号通路增加蛋白激酶G(PKG)的活性而对心脏调节起到负性肌力作用,由于β3-AR在分子结构上的特异性导致其不易发生受体“减敏”现象,因而随着儿茶酚胺的不断增加,其介导负性肌力作用逐渐增强[13]。Rozec等[14]研究表明β3-AR激活后产生的负性肌力作用可以降低心肌收缩力、减少心肌做功和耗氧量,从而抵抗β1-AR、β2-AR过度激活所引起的心脏损伤作用。

然而,也有学者研究发现,通过转基因技术使大鼠心脏过表达人β3-AR后,给予β3-AR特异性的激动剂BRL37344产生正性肌力作用,而这一正性肌力作用是β3-AR与Gs蛋白相偶联并活化腺苷酸环化酶及其下游相关信号所介导的[15]。Mulder等[16]发现β3-AR激动剂奈必诺尔(nebivolol)并不能改善心力衰竭并发房颤患者的心脏功能。同时,本课题组前期研究发现β3-AR激活后可通过TGF-β/Smad信号通路介导心脏纤维化,促进心肌重构[17]。这与Sheng等[18]在用快速起搏诱导心房颤动的犬心力衰竭模型中发现,β3-AR表达上调可导致氧化应激和恶化心脏重构的结果相一致。

上述研究结果的不同可能与样本选择、模型制备及检测方法等条件的不同有关。但是,β3-AR在心力衰竭的心脏中表达上调的结果却是一致的。Moniotte等[7]研究发现心肌梗死患者心脏组织中β3-AR的表达较正常对照组明显升高;Miao等[19]研究发现在主动脉缩窄术所致大鼠心力衰竭的心肌组织中β3-AR表达也明显升高。有研究报道在正常心脏心室肌内膜和外膜β3-AR表达无明显差异,但在心房中的表达高于心室[20]。心力衰竭时,β3-AR表达上调的确切病理生理效应还有争议,亟待进行更加深入、更有针对性的研究来进行明确。

心力衰竭发生的机制主要是神经体液因素的改变,如交感神经系统过度兴奋、肾素-血管紧张素系统激活和细胞因子水平失衡等,其病理生理基础为心脏重塑,主要表现为心肌细胞肥大、心肌间质纤维化和神经体液调节中相关细胞因子的改变。为了更有针对性地检测心力衰竭时β3-AR的表达情况,本研究分离培养NRCM和NRCF,并模拟参与心力衰竭发生发展的两个主要病理系统的激活。结果显示,在AngⅡ所诱导的肾素-血管紧张素系统激活状态,NRCM中β3-AR表达明显增加,而NRCF中β3-AR表达没有明显变化;在NE所诱导的交感神经系统过度兴奋状态,NRCM中β3-AR表达也明显增加,但NRCF中β3-AR表达无明显变化,提示AngⅡ和NE作为参与心力衰竭发生发展的重要病理因素主要引起NRCM中的β3-AR表达,而不是NRCF。因为心肌中NRCF的数量要远多于NRCM,但含有的β3-AR的量却极少,即使是在病理状态下也未见明显增加。这一发现为进一步探讨β3-AR参与心力衰竭病理生理效应的具体作用提供了工作基础,也为β3-AR在心力衰竭中的研究提供新的思路。

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