β-五没食子酰葡萄糖对胰腺癌细胞糖酵解及增殖的影响

陈喜娟，胡立娟，邱帅，杨静，谢俊木子，王丰△

胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，由于发病隐匿，确诊时多已错过最佳治疗时期，加之其对放、化疗不敏感，导致5年生存率低于8%［1］。最近美国癌症协会研究表明，2018年美国将有新发胰腺癌病例近5万人，因胰腺癌死亡的近4万人［2-3］，预计到2030年胰腺癌将成为美国第2大癌症死亡原因［4］。在我国，胰腺癌的发病率和死亡率也呈上升态势，且每年的死亡率几乎等于发病率［5］。缺氧诱发因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在胰腺癌的发生发展中起着调控作用。缺氧不仅能加快肿瘤细胞增殖与存活，还能加快肿瘤细胞的能量代谢［6-8］，使肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性降低。人或其他哺乳动物细胞一般通过氧化磷酸化获取能量，而癌细胞则不同，即使在氧气充足的条件下，也主要依靠糖酵解来获取能量，癌细胞的这一特性称为瓦博格效应。β-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-o-galloyl-β-D-glucose,β-PGG）是一种天然的单宁多酚类化合物，由5个没食子酰基组成，其核心为葡萄糖，具有抗炎、抗癌、降血糖、抗氧化等多种生物学效应［9］。但是，有关β-PGG对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞影响方面的研究尚鲜见报道，本研究旨在探讨β-PGG对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2（#CC2408）购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基购自天润善达公司，胎牛血清购自以色列Bioind公司，β-PGG购自美国Sigma公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司。Western bolt检测中使用的兔源HIF-1α多克隆抗体购自美国Novus公司，兔源葡萄糖转运蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT1）单克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠源磷酸果糖激酶（fructose phosphate kinase，PFK）单克隆抗体、羊源己糖激酶-Ⅱ（hexokinase-Ⅱ，HK-Ⅱ）多克隆抗体和鼠源β-tubulin单克隆抗体均购自美国Sanata Cruz公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体和山羊抗小鼠抗体购自上海良森生物科技有限公司，小鼠抗山羊抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。葡萄糖乳酸试剂盒购于南京建成生物技术有限公司，CCK-8增殖毒性检测试剂盒购于北京碧云天公司，增强化学发光底物检测试剂盒购于美国Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胰腺癌MiaPaCa-2细胞用含10%的胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中传代培养。

1.2.2 CCK-8法检测β-PGG对MiaPaCa-2胰腺癌细胞增殖的作用 取对数生长期的MiaPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔5 000个细胞，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h，用不含血清的DMEM培养基配制β-PGG，使其终浓度分别为5、25、50、100 µmol/L，弃掉细胞上清液，于每孔加配好的药液100µL，每个浓度设5个复孔，以不含β-PGG培养基的细胞作为阴性对照。分别孵育24、48、72 h后，于每孔直接加入10µL CCK-8溶液，培养2 h后在酶标仪450 nm处测定各孔的光密度（OD）值。按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.2.3 乳酸试剂盒检测β-PGG对乳酸生成的影响 取对数生长期的MiaPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，接种于6孔板，37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁生长融合至80%时，用含5.6 mmol/L葡萄糖的KH buffer配制β-PGG，使其终浓度分别为5、50µmol/L，常氧（5%CO2和95%空气、37 ℃）和缺氧（1%O2、5%CO2、94%N2、37℃）条件下孵育细胞4 h，收集上清液，细胞裂解后测定蛋白浓度。按照乳酸试剂盒说明书检测上清液中乳酸的浓度。因KH buffer中除葡萄糖外不含其他可生成乳酸的物质，测得的乳酸均来自葡萄糖的酵解，即为乳酸的生成量。为抵消细胞群落大小不一可能给实验结果带来的影响，全部结果均先行用同组细胞总蛋白量进行修正。

1.2.4 蛋白印迹法检测β-PGG对HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表达的影响 用不含血清的DMEM培养基配制β-PGG，使其终浓度分别为5、13、25、50、100 µmol/L，缺氧条件下（1%O2、5%CO2、94%N2、37 ℃）处理细胞4 h，裂解细胞，收集蛋白。取20µg蛋白于SDS-PAGE电泳，蛋白印迹检测HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK的表达。一抗孵育过夜，二抗孵育2 h，以β-tubulin作为内参，增强化学发光底物试剂盒检测曝光，应用NIH Image J软件进行分析，以目的蛋白/内参蛋白的灰度值作为蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 应用统计分析软件包SPSS 17.0进行统计学分析，符合正态分布的计量数据用±s表示，2组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-PGG对MiaPaCa-2胰腺癌细胞增殖的抑制作用 CCK-8结果显示，不同浓度的β-PGG（5、25、50、100µmol/L）均能有效抑制MiaPaCa-2细胞的增殖，且抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强，呈现出剂量依赖性和时间依赖性，见表1。

Tab.1 The effects of β-PGG on cell proliferation in human pancreatic cancer Miapaca2 cell line detected by CCK-8 method表1 CCK-8法检测β-PGG对Miapaca2体外增殖抑制率的影响 （%，±s）

Tab.1 The effects of β-PGG on cell proliferation in human pancreatic cancer Miapaca2 cell line detected by CCK-8 method表1 CCK-8法检测β-PGG对Miapaca2体外增殖抑制率的影响 （%，±s）

＊＊P＜0.01；同一时点组间，a与对照组比较，b与5 µmol/L组比较，c与25µmol/L组比较，P＜0.05；组内不同时点，A与24 h组比较，B与48 h组比较，P＜0.05

组别对照组5µmol/L组25µmol/L组50µmol/L组100µmol/L组F 24 h(n=4)0 17.72±7.12a 47.02±5.72ab 56.32±1.22abc 61.33±5.07abc 126.822＊＊48 h(n=4)0 36.79±16.51a 74.06±1.64abA 75.06±3.45abA 79.64±1.70abA 81.265＊＊72 h(n=3)0 37.38±16.16a 80.14±3.69abA 82.82±1.27abAB 82.97±0.78abA 74.575＊＊F-2.551 68.992＊＊124.055＊＊46.366＊＊-

2.2 β-PGG对MiaPaCa-2胰腺癌细胞乳酸生成的影响 无论在常氧或缺氧条件下，与对照组相比，5µmol/L组及50µmol/L组的乳酸生成均表现出逐渐下降趋势，其中在50µmol/L处理组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；在对照组，缺氧条件下乳酸的生成明显多于常氧，差异有统计学意义（t=12.375，P＜0.05），见表2。

Tab.2 Effects of different β-PGG concentrations on lactate production in MiaPaCa-2 cells表2 不同浓度β-PGG对MiaPaCa-2细胞乳酸生成的影响（±s）

Tab.2 Effects of different β-PGG concentrations on lactate production in MiaPaCa-2 cells表2 不同浓度β-PGG对MiaPaCa-2细胞乳酸生成的影响（±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与5 µmol/L组比较，P＜0.05

组别对照组5µmol/L 50µmol/L F常氧（n=8）5.91±0.89 5.59±2.26 2.81±1.52ab 8.54＊＊缺氧(n=4)25.11±1.53 22.86±2.23 18.66±2.90a 8.177＊＊

2.3 β-PGG对MiaPaCa-2胰腺癌细胞HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表达的影响 Western blot结果显示，β-PGG能抑制HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ、PFK的蛋白表达，且随着β-PGG浓度越高，抑制效果越明显（P＜0.05），见图1，表3。

Fig.1 Expressions of HIF-1α,GLUT1,HK-Ⅱand PFK detected by Western blot assay图1 Western bolt检测HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK蛋白的表达

Tab.3 Effects of different β-PGG concentrations on HIF-1α,GLUT1,HK-Ⅱand PFK expressions in MiaPaCa-2 cells表3 不同浓度β-PGG对MiaPaCa-2细胞HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表达的影响 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of different β-PGG concentrations on HIF-1α,GLUT1,HK-Ⅱand PFK expressions in MiaPaCa-2 cells表3 不同浓度β-PGG对MiaPaCa-2细胞HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表达的影响 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与5µmol/L组比较，c与13µmol/L组比较，d与25µmol/L组比较，e与50µmol/L组比较，P＜0.05

组别HIF-1αGLUT1HK-ⅡPFK对照组5µmol/L 13µmol/L 25µmol/L 50µmol/L 100µmol/L F 1.16±0.21 0.99±0.02 0.86±0.14a 0.75±0.12ab 0.59±0.22abc 0.42±0.13abcd 9.011＊＊1.03±0.14 1.06±0.12 1.09±0.04 1.01±0.02 0.81±0.03abcd 0.67±0.19abcd 7.256＊＊1.02±0.14 1.09±0.01 1.05±0.06 0.79±0.14abc 0.76±0.19abc 0.46±0.18abcde 9.585＊＊1.29±0.13 1.25±0.05 1.00±0.11ab 0.85±0.06abc 0.61±0.08abcd 0.33±0.14abcde 40.31＊＊

3 讨论

β-PGG是从中药中提取的小分子化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗血管生成、抗增殖、降血糖、诱导细胞凋亡、抑制DNA的复制合成、引起细胞周期S期和G1期阻滞等作用。近年来研究发现，β-PGG在前列腺癌、白血病、乳腺癌、肺癌、口腔癌等多种细胞实验中表现出良好的诱导细胞凋亡、抑制癌细胞增殖和抑制肿瘤血管生成等作用［10-11］。

已有研究发现，β-PGG可以抑制人乳腺导管癌细胞系T-47D和BT-474的增殖［12］。本研究结果显示，随着β-PGG浓度的增加和时间的延长，MiaPaCa-2细胞的增殖活性明显降低，在100µmol/L的浓度处理72 h，其抑制率高达（82.97±0.78）%，表明β-PGG可以抑制MiaPaCa-2细胞的增殖。经5µmol/L和50µmol/L的β-PGG处理后，MiaPaCa-2胰腺癌细胞上清液的乳酸含量均较对照组减少，表明β-PGG能抑制乳酸的生成。

Park等［13］发现，在前列腺癌细胞系LNCaP中，β-PGG可以抑制HIF-1α的积累、转录激活及mRNA的表达，通过抑制血管生成，从而抑制肿瘤细胞的活性。包括胰腺癌细胞在内的许多癌细胞能表达HIF-1α，继而表达HIF-1［14-15］，癌细胞表达HIF-1主要是由于两个原因，一是肿瘤细胞中癌基因的表达加快了HIF-1α的生成，二是肿瘤内的缺氧环境抑制了HIF-1α的降解。HIF-1α的表达使HIF-1靶基因的转录加快，进而从以下几个方面影响了癌细胞的生存能力［16］：（1）大量表达糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白1，将糖酵解（即瓦博格效应）维持在高水平。（2）抗凋亡能力和增殖能力增强。（3）癌细胞侵袭性增强。（4）癌细胞血管生成能力增强。若能干预胰腺癌的缺氧应答，抑制缺氧相关的靶分子，即可以延缓或阻止胰腺癌的进展。因此，HIF-1α对肿瘤的瓦博格效应具有调控作用。HK-Ⅱ、PFK以及GLUT1是HIF-1α的靶基因，均受HIF-1α的调控，癌细胞在表达HIF-1α后糖酵解能力会全面加强。因此，抑制了癌细胞的HIF-1α，就能降低该细胞的糖酵解率。本研究主要检测了β-PGG在缺氧条件下处理胰腺癌细胞后GLUT1、糖酵解关键酶HK-Ⅱ和PFK-1的表达，结果显示β-PGG抑制HIF-1α表达后，这些靶蛋白的表达均下降，即抑制了HIF-1α后，癌细胞的瓦博格效应得到抑制。

综上所述，β-PGG能抑制人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2的生长及乳酸的生成，其抑制作用是通过抑制HIF-1α和GLUT1以及糖酵解途径的关键酶HK-Ⅱ和PFK的表达实现的。β-PGG可以作为一种预防和治疗癌症的新型候选药物。