Shh通路介导损伤后反应性星形胶质细胞获得干细胞潜能

许子宁 ，李晓红，叶益超，刘晓银，3，涂悦△

星形胶质细胞（astrocytes，AST）是神经组织中最重要的胶质细胞，其主要作用是为神经元的代谢提供营养物质支持、维持细胞内环境稳态、积极参与神经回路构成等［1］。中枢神经系统受损之后，引起一系列急性的反应，AST会被激活，从而形成“反应性星形胶质细胞（reactive astrocytes，RAS）”［2］。RAS的过度增生会形成胶质瘢痕，阻碍神经元轴突再生，从而影响神经功能的恢复［3］。不同的损伤类型会诱导不同类型的RAS。已有研究证明，激活的小胶质细胞分泌的肿瘤坏死因子（TNF）-α，白细胞介素（IL）-1α和C1q会诱导AST形成神经炎症性反应性星形胶质细胞［4］。Shh（sonic hedgehog，Shh）是成年哺乳动物中枢神经系统中表达的唯一的Hh蛋白质，Shh信号通路在经典途径中由其补体受体（Ptch-1）和Smo以及转录因子Gli蛋白组成，在胚胎神经发育阶段起到关键作用［5］。近年来，研究人员利用Shh信号通路参与肝胆管的损伤后修复［6］，调节宫颈癌干细胞的特征［7］，改善椎间盘疾病［8］等。该通路在神经系统疾病中对受损的神经功能也具有一定的修复作用。本文通过添加Shh信号通路的激活剂和抑制剂，探讨该通路对不同损伤诱导的RAS转分化为神经干细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD孕鼠1只，由中国人民武装警察部队特色医学中心提供［许可证号SCXK-（军）2012-0004］，购自斯贝福实验动物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM/F 12培养基、胎牛血清（FBS）（Gibco，美国），小鼠抗Nestin抗体（Abcam，英国），兔抗GFAP抗体（Sigma，美国），兔抗Shh抗体（Proteintech，美国），山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美国），IL-1α（Sigma，I3901）、TNF-α（Cell signaling technology，8902SF），C1q（My bio source，MBS143105），Shh 通 路 激 动 剂（smoothened agonist，SAG）（MCE，HY-12848）、Shh 通路抑制剂环巴胺（cyclopamine，CYC）（MCE，HY-17024），总RNA提取试剂盒（离心柱型）（天根生化科技有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司），ABI 7300荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司），倒置荧光显微镜（Leica DMI4000B）。

1.3 方法

1.3.1 原代AST的提取和鉴定 取1～3 d新生SD大鼠，用75%乙醇浸泡5 min消毒表皮，无菌条件下剪开头皮与颅骨，暴露大脑，钳取皮层部分放入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中充分漂洗，随后放入DMEM/F 12培养基中并于冰上剔除脑膜和血管等组织，将组织转移至15 mL离心管中并加入0.25%的胰蛋白酶，置于37℃、5%CO2细胞孵箱消化5 min，用培养基终止消化，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含有10%FBS的DMEM/F 12培养基重悬沉淀后置于培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养2 h进行差速黏附，吸出悬液。之后使用200目不锈钢滤网进行研磨过滤，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含有10%FBS的DMEM/F 12培养基继续培养至细胞融合度80%～90%，置于恒温摇床振荡16 h（37℃、260 r/min），换液继续培养并检测纯度，以备后用。

1.3.2 免疫荧光技术检测AST纯度 细胞计数板调整星形胶质细胞浓度为1×105/mL后接种于48孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞贴壁，4%多聚甲醛固定后，0.5%Triton X-100破膜，5%BSA封闭，使用胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（1∶1 000）抗体进行免疫荧光染色，4℃过夜。次日使用山羊抗小鼠IgG二抗37℃孵育1 h，全程避光操作。在荧光显微镜下取6个视野，拍照并计算GFAP阳性细胞数占细胞总数的百分比。

1.3.3 实验分组 实验分为对照组、炎症组和划痕组。对照组细胞为普通星形胶质细胞，置于37℃、5%CO2孵箱中正常培养。炎症组在普通星形胶质细胞中加入IL-1α（3µg/L）、TNF-α（30 µg/L）、C1q（400µg/L）。划痕组细胞是将星形胶质细胞以1×104/mL种植于24孔板，用10µL无菌加样枪头“井”字划痕，划痕间距0.3 mm，注意划痕时保持匀速和相同力度。划后换液除去脱落和死亡细胞及碎片，每隔3 d半量换液。

1.3.4 免疫荧光染色法检测Nestin表达量 炎症组培养至干预后24 h，对照组和划痕组培养至第5天，4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗3×5 min，使用0.5%Triton X-100破膜20 min，PBS浸洗3×5 min，5%BSA封闭20 min之后加入Nestin（1∶100）抗体，4 ℃过夜。第2天复温20 min，PBS浸洗3×5 min，后续操作避光，加入山羊抗小鼠IgG二抗（1∶200），37℃孵育1 h，PBS浸洗3×10 min，加入DAPI（1∶100）染核，37℃孵育10 min，PBS浸洗3×10 min后荧光显微镜观察并拍照。

1.3.5 Western blot检测Shh蛋白表达量 炎症组培养至干预后24 h、划痕组培养至第5天提取细胞蛋白，将提取出的细胞蛋白与5×上样缓冲液按体积比4∶1比例制备样品，放入100℃水浴锅中加热煮沸5～7 min进行变性。使用BCA蛋白定量法，绘制蛋白光密度（OD）值的标准曲线，计算出各个样品蛋白浓度。配制10%分离胶（下层）和浓缩胶（上层）后将电泳缓冲液倒入电泳槽中，以80 V电压进行电泳20 min，后调制电压为120 V，直至电泳结束。进行半干转，脱脂奶粉溶液封闭1 h，孵育一抗Shh（1∶2 000）、过夜，孵育二抗，显色显影液A∶显影液B=1∶1比例配用，显影并保存图片。用Image J图像处理软件测量条带灰度值，目的蛋白的相对表达量为目的条带灰度值与内参比值。

1.3.6 Shh信号通路的干预 3组细胞培养至第7天，更换神经干细胞条件培养基（DMEM/F 12、20 mg/L EGF、20 mg/L BFGF、2%B27）后，对上述3组细胞分别添加Shh激活剂（smoothened agonist，SAG，1 µmol/L）和抑制剂（cyclopamine，CYC，3µmol/L），37℃细胞培养箱中培养14 d行后续实验。

1.3.7 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测各组中神经干细胞相关基因表达水平 将各组细胞按照每皿1.0×105/mL密度接种，培养24 h后待细胞贴壁，提取样本mRNA，使用罗氏（Rocke）反转录试剂盒反转录为cDNA。在荧光定量PCR仪中检测神经干细胞相关基因的表达。内参与检测样本均设置3个复孔，全程冰上操作。qRT-PCR结果分析保证3复孔同Ct值相差-0.3～0.3，取复孔平均值以减少误差，以β-actin作为内参。神经干细胞相关基因引物序列见表1。PCR反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s、60℃退火延伸1 min，40个循环。以β-actin作为内参，应用7300 system software分析检测数据。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）干预组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，计算2-ΔΔCt值为目的基因的相对表达水平。

Tab.1 The specific primer sequences of neural stem cells表1 神经干细胞qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件分析数据，所得数据以均数±标准差（±s）表示，2组间数据比较采用独立样本t检验，3组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），组间多重比较使用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AST的培养及纯度鉴定 提取后的原代星形胶质细胞传至第3代后，细胞核呈圆形或卵圆形，细胞突触粗短，且分支较多，胞体较小。免疫荧光染色检测纯度为荧光显微镜下GFAP阳性细胞数所占细胞总数的百分比，结果显示纯度为94.11%，符合后续实验要求，见图1。

Fig.1 Purity detection of primary astrocytes(×200)图1 原代星形胶质细胞的纯度检测（×200）

2.2 各组细胞中Nestin蛋白的表达量 倒置荧光显微镜下观察，结果显示划痕组的Nestin表达量明显高于对照组和炎症组，见图2。

Fig.2 The Nestin expression of RAS in each group analyzed by immunofluorescence(immunofluorescence staining,×200)图2 免疫荧光染色检测各组RAS的Nestin表达（免疫荧光染色，×200）

2.3 不同损伤类型细胞中Shh蛋白表达量 Western blot结果显示，划痕组Shh蛋白表达量明显高于炎症组（0.768±0.341vs.0.094±0.026，n=3，t=3.412，P＜0.05），见图3。

Fig.3 The shh expressions of RAS in different injured groups analyzed by Western blot assay图3 Western blot检测不同损伤组RAS的Shh表达量

2.4 Shh激活剂对不同损伤类型诱导RAS源性神经干细胞基因表达的影响 添加Shh信号通路激活剂SAG后的对照组中神经干细胞相关基因表达量较低，炎症组较对照组有所升高（P＜0.01），划痕诱导RAS的神经干细胞相关基因表达量较炎症组和对照组均有明显增高（P＜0.01），见表2。

2.5 Shh抑制剂对不同损伤类型诱导RAS源性神经干细胞基因表达的影响 添加Shh信号通路的抑制剂cyclopamine后3组中神经干细胞相关基因表达量明显降低，炎症组较对照组略有升高（P＜0.01），划痕诱导RAS的表达量较炎症组和对照组仍有一定增高趋势（P＜0.01），见表3。

3 讨论

3.1 RAS的特点 AST受损后，胞体肥大、周围突起增多、延展性好、胞浆丰富。这些不同程度的防御性改变统称为“星形胶质细胞反应性胶质化”。有研究表明，通过对小鼠进行炎症因子诱导神经炎症和大脑中动脉闭塞诱导脑缺血缺氧，会产生2种不同的RAS：即A1型RAS和A2型RAS，A1型RAS基本不表达Nestin，且这2种不同的RAS表面基因以及对神经系统的作用皆不相同［9］。因此需要研究和利用不同的RAS，以达到修复神经系统损伤的目的。本研究通过在AST中添加IL-1α、TNF-α和C1q三种因子作为炎症RAS模型，以划痕实验制备创伤RAS模型，通过免疫荧光染色分析神经干细胞的特异性标志物Nestin在不同损伤细胞模型中的表达量，发现炎症诱导的RAS中Nestin的表达量低于创伤诱导的RAS。出现这一结果可能是因为不同的损伤方式对AST活化的程度有影响，导致活化后不同损伤类型的RAS出现差异。所以，探究炎症诱导的RAS和创伤诱导的RAS到底具有哪些差异可以成为后续研究的问题。

Tab.2 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with SAG表2 qRT-PCR检测各组细胞添加SAG后神经干细胞相关基因的表达量 （n=3，±s）

Tab.2 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with SAG表2 qRT-PCR检测各组细胞添加SAG后神经干细胞相关基因的表达量 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照+SAG组比较，b与炎症+SAG组比较，P＜0.05

组别对照组对照+SAG组炎症+SAG组划痕+SAG组F Nestin 1.000±0 0.421±0.109 2.381±0.153a 5.354±0.845ab 74.065＊＊Pax-6 1.000±0 0.173±0.090 1.462±0.172a 2.654±0.486ab 50.516＊＊Sox-2 1.000±0 0.343±0.122 1.449±0.110a 3.250±0.148ab 397.170＊＊Oct-4 1.000±0 0.244±0.062 1.536±0.256a 2.404±0.310ab 64.308＊＊Map-2 1.000±0 0.156±0.033 1.236±0.252a 3.801±0.639ab 66.731＊＊

Tab.3 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with cyclopamine表3 qRT-PCR检测各组细胞添加环巴胺后神经干细胞相关基因的表达量 （n=3，±s）

Tab.3 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with cyclopamine表3 qRT-PCR检测各组细胞添加环巴胺后神经干细胞相关基因的表达量 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照+CYC组比较，b与炎症+CYC组比较，P＜0.05

组别对照组对照+CYC组炎症+CYC组划痕+CYC组F Nestin 1.000±0 0.029±0.017 0.125±0.026a 0.222±0.031ab 44.290＊＊Pax-6 1.000±0 0.021±0.019 0.101±0.019a 0.176±0.048ab 17.958＊＊Sox-2 1.000±0 0.040±0.024 0.126±0.028a 0.194±0.010ab 36.623＊＊Oct-4 1.000±0 0.029±0.016 0.100±0.021a 0.171±0.034ab 24.590＊＊Map-2 1.000±0 0.013±0.007 0.080±0.021a 0.202±0.010ab 142.947＊＊

3.2 Shh蛋白在不同损伤模型中的表达差异 Shh作为一个重要的调节通路，在神经系统中有着不可忽视的作用［10］。正常的中枢神经系统中，星形胶质细胞对Shh分泌较少甚至不分泌。而据报道，脑创伤等大脑侵袭性损伤相比大脑慢性淀粉样变性或诱导性神经元死亡等非侵袭性损伤导致的脑疾病可引起细胞分泌更多Shh蛋白，从而激活了Shh信号通路，使该通路能够促进具有神经干细胞特性的RAS在体内增殖［11］。在本研究中，通过Western blot检测炎症组和划痕组的Shh表达量，发现划痕诱导RAS中Shh表达水平明显高于炎症诱导的RAS，这一现象即说明Shh的大量释放是依赖于侵袭性损伤而不是神经炎症等非侵袭性损伤。

3.3 Shh信号通路的激活和抑制 SAG作为Shh信号通路特异性激活剂，是一种苯并噻吩化合物，通过调节跨膜蛋白smo与下游效应子的结合来激活通路，对神经发生和神经元的存活均表现出有益的作用［12］。Cyclopamine是一种甾体生物碱，具有致畸性和抗瘤性，通过其高亲和力直接与smoothened结合来阻断shh信号通路，从而抑制细胞生长［13］。在本研究中，添加SAG后，创伤诱导的RAS相比炎症诱导的RAS能表达更多神经干细胞的相关基因，这说明Shh信号通路大量的激活使得创伤性RAS基因组开始转录和翻译为神经干细胞；而炎症组较对照组细胞基因的升高是细微的。这种结果的出现可能是因为创伤性RAS相比炎症性RAS具有发展为神经干细胞的潜能，Shh信号通路的大量激活使其潜能逐渐被激发。在添加cyclopamine后，对照组神经干细胞的相关基因表达量极低，但划痕组表达量明显较炎症组仍具优势，这种结果可能是因为添加抑制剂后细胞培养的时间较长，导致cyclopamine抑制效果逐渐减弱并恢复了部分Shh信号通路传导，但创伤诱导RAS较炎症诱导RAS释放更多的Shh，因此仍能够提高部分神经干细胞相关基因的表达。

3.4 Shh信号通路诱导RAS获得干细胞潜能的优缺点 在损伤后具有神经干细胞特征的细胞可以为内源性神经修复提供重要的新资源，调节和控制Shh信号通路来治疗中枢神经系统疾病是一种具有潜力的方法。在发生脑损伤后，Shh信号通路不仅可以帮助损伤后内源性神经干细胞扩散［14］，还可以使受损后RAS启动内源性神经保护功能［15］。外源性激活Shh通路亦可促进RAS介导的神经保护作用［16］。该信号通路的神经保护作用能够减少星形胶质细胞的反应性并维持正常神经系统的微环境［17］。因此，可以认为Shh信号通路是RAS转分化的关键因素。虽然Shh信号通路具有良好的修复作用，但其中的某些转录因子易激活体内致癌靶点，加速肿瘤的发生与增殖［18］。因此，Shh信号通路不当的激活会加速肿瘤干细胞的无限增殖，从而引起各种类型癌症或者加重癌变程度。本研究发现，单凭Shh信号通路不足以将RAS真正地诱导为神经干细胞。考虑该信号通路具有一定致瘤性，因此在运用时应考虑是否通过添加转录因子等方法提高诱导效率，并控制Shh激活剂或抑制剂的用量来防止其致瘤性。

综上所述，本研究证明不同类型的RAS对Shh的释放有差异，而Shh信号通路可以介导损伤后RAS表达神经干细胞相关基因，从而使得其获得神经干细胞潜能。为进一步证明诱导的RAS源性神经干细胞是否具有多能性提供了理论依据。