细胞交互作用在重叠综合征所致血管内皮损伤中及与细胞间黏附分子-1的作用研究

肖凡，曹洁，李鑫

呼吸重叠综合征（respiratory overlap syndrome，OS）最初由David C.Flenley于1985年提出，用于描述慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea，OSA）的共存现象［1］。OSA主要病理特征为睡眠间歇性低氧（intermittent hypoxia，IH），此种低氧模式可以造成人体全身多系统损伤，其中以心血管系统损伤最为常见和严重［2］。COPD主要以不完全可逆的气流受限为特征，中重度患者可引发慢性持续低氧（continuous hypoxia，CH），心血管疾病为其最重要的合并症［3］。OS同时存在IH和CH，与单独发生的COPD或OSA相比，OS患者的心血管事件发生率和死亡率均明显增加［4］。

内皮细胞损伤或活化引起的内皮细胞调节功能的改变会导致内皮功能障碍，而血管性疾病的重要环节为血管内皮功能障碍。笔者团队前期研究证实 ，中性 粒 细胞（Polymorphonuclear neutrophlis，PMN）与血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）共培养后重叠低氧暴露模式与单纯IH低氧暴露模式或单纯CH低氧暴露模式相比较，炎症反应及氧化应激更剧烈、内皮细胞凋亡加速更明显，内皮损伤更严重，提示炎症反应、氧化应激及凋亡基因共同参与了OS所致血管内皮损伤，且具有时间依赖性［5］。本研究将从细胞水平探讨PMN与VEC的交互作用在重叠综合征所致血管内皮损伤中的重要作用及与细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的作用机制，以进一步探讨重叠低氧模式暴露所致内皮细胞损伤的可能发病机制。

1 资料与方法

1.1 主要材料与试剂 混合气体（天津六方气体高科技有限公司）；酶标仪（美国Thermo Science公司）；ICAM-1试剂盒、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α试剂盒、白细胞介素（Interleukin，IL）-6试剂盒（美国RD公司）；过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物公司）；梯度聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；荧光定量PCR仪（美国Roche公司，LC96）；Bak引物、Bcl-xl引物、10×RT（天津南天生物技术有限公司）；TransScript RT、双蒸水（double distilled water，ddH2O；天津南天生物技术有限公司）；RPMI-1640培养基（Gibco）；胰蛋白酶（美国，GIBCO公司）；TRIzol RNA分离试剂（美国，Invitrogen公司）；通用反转录试剂盒（M-MLV）逆转录酶（美国Promega Leiden公司）；SYBR Green（美国，AMBION公司）；实时荧光定量PCR引物（美国，Thermo Fisher公司）；可见光分光光度计（德国，Eppendorf）；可调到95℃左右的恒温浴箱（北京市光明医疗仪器厂）。

1.2 细胞的准备

1.2.1 PMN的提取 选取来源于天津市第三中心医院分院健康体检中心的健康成年体检者160例，符合以下条件：（1）既往无呼吸系统、心血管系统、神经系统、肝脏、肾脏等器质性疾病病史。（2）通过病史、体格检查、胸部X线及肺功能检查除外COPD。（3）否认睡眠打鼾史、呼吸暂停史，否认白天嗜睡等既往史。每次每人抽取空腹8 h以上外周静脉血2.5 mL，共16人次，每次取样共40 mL，先后共进行10次取样。使用双层密度梯度离心法从血样中分离PMN，吉姆萨染色PMN纯度大于96%，生存率由台盼蓝染色确定大于99%，健康志愿者均签署知情同意书。

1.2.2 人VEC的制备 采用人脐静脉内皮细胞系EA.hy926。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）水浴复苏后接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基，置于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱培养。传2～3代待其稳定后取对数生长期细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶及2 g/L的EDTA消化，终止消化后吸管反复吹打制成单细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为3×106/mL，按1 mL/孔接种于6孔板，于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养48 h，待细胞贴壁后采用无血清培养基冲洗，调整无血清培养基至1 mL/孔（培养基厚度约为3 mm），pH值调至7.4后开始低氧暴露。

1.2.3 细胞培养 （1）PMN与VEC直接共培养：纯化的PMN在RPMI 1640培养基中重悬，细胞浓度为1×106/mL，按1 mL/孔直接接种于VEC培养皿中（PMN与VEC数量比为10∶1）。（2）将PMN与VEC直接共培养组的6孔培养板与制备好的单纯VEC组培养皿同时置于37℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内共培养4 h，后进行低氧暴露8 h。

1.3 实验设计

1.3.1 暴露装置 采用天津医科大学总医院呼吸与危重症学科呼吸仿真系统1.0，按照编写程序控制间歇低氧/复氧循环次数及循环时间，根据单片机的预置程序，对固态继电器进行控制，间接控制电磁阀的开关，然后开启/关闭预混气体流量。细胞培养舱是自行设计制造，采用恒温器、加热加湿器和微孔膜保证培养箱内为37℃、45%～70%湿度的无菌环境；细胞培养舱容量1.8 L，洗脱流速：0.083 L/s，实测洗脱时间约30 s，暴露时间段以前，均含30 s洗脱时间。该暴露装置已被证实可以模拟多种间歇低氧/再氧合模式的暴露条件，并与低氧相关疾病的整体水平与细胞水平病生理的真实情况基本一致［6］。

1.3.2 实验分组 将PMN与VEC直接共培养组设为实验组，VEC单独培养组设为对照组，将实验组与对照组均进行8 h间歇伴持续低氧。低氧暴露方案：1.5%O215 s+10%O23 min 45 s，低氧暴露结束后收集2组细胞上清液，实验组及对照组均采用PBS反复冲洗后收集贴壁VEC，收集的上清液和VEC冻存于-80℃冰箱。

1.4 检测指标 （1）通过双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）法按试剂盒说明操作检测提取的上清液的炎症因子IL-6、TNF-α及ICAM-1。（2）应用化学试剂法按试剂盒说明检测上清液的CAT活性和MDA浓度。（3）实时荧光定量PCR（qRTPCR）技术检测VEC促凋亡基因Bak和抑凋亡基因Bcl-xlmRNA表达情况。从-80℃冰箱取出VEC，融化后采用TRIzol法提取总RNA，用Thermo Nano Drop 2000测定RNA浓度。将200 ng总RNA用M-MLV逆转录酶进行反转录反应，以反转录产物作为模板，SYBR GreenⅠ作为荧光染料进行实时荧光定量PCR。Bak引物，上游5′-CCCAGGACACAGAGGAGGTTT-3′，下游 5′-GCCTCCTGTTCCTGCTGATG-3′，扩增片段长度65 bp；Bcl-xl引物，上游5′-TGCGTGGAAAGCGTAGACAA-3′，下游5′-ATTCAGGTAAGTGGCCATCCAA-3′，扩增片段长度75 bp；GAPDH引物，上游5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游 5′-CATGAGTCCTTCCACGATACCA-3′，扩增片段长度102 bp。以GAPDH作为内参照，以未转染的空白对照组细胞作为校正样本，采用2-ΔΔCt的相对定量方法进行分析 ，ΔΔCt=［ 实 验 组（目的基因Ct-内参对照Ct）- 对照组（目的基因Ct-内参对照Ct）］。

1.5 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间数据比较采用独立样本t检验；将实验组ICAM-1与各变量进行Pearson相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组炎症因子及氧化应激指标比较 实验组IL-6、TNF-α、ICAM-1及MDA水平均高于对照组，而CAT的活力值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

Tab.1 Comparison of indexes of inflammation and oxidative stress between control group and experimental group表1 对照组与实验组炎症因子及氧化应激指标比较（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of indexes of inflammation and oxidative stress between control group and experimental group表1 对照组与实验组炎症因子及氧化应激指标比较（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别对照组实验组t炎症因子（ng/L）IL-6 22.42±2.27 151.77±35.90 11.370＊＊TNF-α 226.68±4.68 267.46±43.10 2.975＊ICAM-1（µg/L）0.97±0.15 1.64±0.10 11.931＊＊MDA（nmol/L）22.68±3.18 27.04±2.41 3.452＊CAT（U/mL）11.15±0.83 7.55±1.34 7.210＊＊

2.2 2组Bak、Bcl-xlmRNA相对表达水平比较 实验组Bak和Bcl-xlmRNA相对表达水平均高于对照组，而Bcl-xl/Bak低于对照组（P＜0.05），见表2。

Tab.2 ComparisonofrelativeexpressionlevelsofBakand Bcl-xlmRNAbetweencontrolgroupandexperimentalgroup表2 2组Bak mRNA、Bcl-xl mRNA相对表达水平比较（n=10，±s）

Tab.2 ComparisonofrelativeexpressionlevelsofBakand Bcl-xlmRNAbetweencontrolgroupandexperimentalgroup表2 2组Bak mRNA、Bcl-xl mRNA相对表达水平比较（n=10，±s）

＊＊P＜0.01

组别Bak mRNA Bcl-xl mRNA Bcl-xl/Bak对照组实验组t 2.04±0.22 3.44±0.62 6.743＊＊1.33±0.09 1.73±0.09 9.968＊＊0.69±0.08 0.34±0.08 10.077＊＊

2.3 ICAM-1与各变量相关性分析 ICAM-1与IL-6、TNF-α、MDA呈正相关，而与CAT、Bcl-xl/Bak呈负相关（均P＜0.05），见表3。

Tab.3 Correlation analysis of ICAM-1 and various variables表3 ICAM-1与各变量相关性分析

3 讨论

细胞交互作用机制在血管内皮细胞损伤过程中起重要作用，特别是以PMN为代表的炎症细胞与VEC间的交互作用成为内皮细胞损伤的关键环节［7］。血管内皮是全身炎症反应的主要部位，而血管内皮细胞是保证血管正常功能的重要细胞，血管内皮功能障碍主要表现为血管内皮细胞的损伤［8］。在正常状态下，VEC处于未激活状态，能对循环细胞与VEC的聚集和黏附起抵抗作用，VEC与PMN的黏附分子表达也处于基础水平。研究显示，当低氧时，VEC会出现功能障碍，进而引发心脑血管疾病和全身系统性损害的发生［8］。

现在，学者们已经越来越关注到细胞与细胞间的交互作用与疾病的发生发展间的关系，比如肿瘤、急性肺损伤［9］等。在低氧相关疾病方面，研究比较多的集中于OSA的IH所致的PMN［10］或淋巴细胞［11］与VEC交互作用，且多处于动物实验阶段。目前尚少见关于重叠综合征细胞交互作用的研究，尤其是细胞水平的研究。本研究探索性地将PMN与VEC直接共培养设为实验组，单纯VEC培养设为对照组，共同进行重叠模式低氧暴露，结果发现实验组IL-6、TNF-α、ICAM-1及MDA的表达水平均高于对照组，而抗氧化指标CAT的活力值低于对照组；同时实验组凋亡相关基因Bak、Bcl-xlmRNA相对表达水平均高于对照组，而Bcl-xl/Bak低于对照组，表明实验组无论炎症反应、氧化应激反应、还是内皮细胞凋亡速度均比对照组明显加快，提示PMN与VEC的交互作用在其中起了重要作用。其机制考虑与Kent等［12］研究相仿：IH激活PMN，ROS产生增加，加强了PMN与VEC的黏附；同时IH亦激活内皮细胞，黏附分子、炎症趋化因子、促炎因子的炎症通路被激活，进一步趋化PMN向VEC黏附；PMN释放蛋白溶解酶、白细胞三烯、炎性细胞因子以及增加ROS产生，进而加速VEC损伤和凋亡。同时氧化/抗氧化状态失衡，通过接触依赖的方式，释放多种炎性介质及转录因子参与VEC损伤及凋亡。但依据笔者团队前期研究结果，重叠低氧模式暴露下PMN与VEC交互作用比IH低氧模式暴露更剧烈［5］。由此，重叠低氧状态下PMN与VEC的交互作用可使内皮细胞损伤相关的炎症、氧化应激及内皮细胞凋亡更加剧烈，即PMN与VEC间的交互作用促使重叠综合征所致血管内皮损伤更严重。

另外，在重叠模式低氧暴露下实验组ICAM-1与IL-6，TNF-α，MDA呈正相关，与CAT，Bcl-xl/Bak呈负相关，表明在重叠低氧模式暴露下PMN与VEC的交互作用中ICAM-1起了重要作用。Fotis等［13］研究亦显示，白细胞与血管内皮细胞在循环中的黏附是血管内皮损伤和动脉粥样硬化发病的标志，其特征在于黏附分子的过表达。ICAM-1属于黏附分子免疫球蛋白超家族中的成员之一，主要分布于内皮细胞和白细胞表面，在血管病变中起重要作用。正常情况下ICAM-1很少表达或不表达，在低氧、炎症刺激物、氧化物等作用下促进VEC表达ICAM-1，增强PMN与VEC间的黏附作用，促进血管内皮的损伤。本实验结果表明，ICAM-1与炎症因子、氧化应激指标及凋亡相关基因有较高的相关性。Collins等［14］研究显示，缺乏ICAM-1的小鼠动脉粥样硬化病变大幅度减少，认为这可能与缺乏ICAM-1而使其介导的PMN黏附减少有关。血清ICAM-1能敏感反应炎症水平。Meta分析表明OSA患者ICAM-1表达水平增加，并随严重程度的增加而增加［15］。低氧可使ICAM-1表达增加，从而介导PMN向内皮细胞迁移，进而抑制PMN的凋亡［16］。PMN在炎症部位存活时间的延长会产生过多有害物质，从而扩大炎症反应，加速内皮细胞凋亡［17］。中性粒细胞释放的过氧化氢是内皮细胞功能的重要介质。Habas等［18］研究显示，过氧化氢诱导的氧化应激可促进ICAM-1水平升高，影响内皮细胞功能，这可能是动脉粥样硬化的形成因素之一；另外，这种升高可以通过N-乙酰半胱氨酸（NAC）抗氧化作用来降低，表明ICAM-1与氧化应激指标相关。陈铁龙等［19］研究显示，TNF-α能明显增加HUVEC的凋亡率，同时上调ICAM-1在HUVEC中的表达，TNF-α可抑制内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的释放，并激活核因子（nuclear factor，NF）-κB、转录激活蛋白（activator protein，AP）-1的表达，表明ICAM-1与TNF-α水平有相关性，与本研究结果一致。

综上所述，ICAM-1与炎症、氧化应激及细胞凋亡有较高的相关性，炎症和氧化应激相关因子可刺激内皮细胞产生ICAM-1增多，而ICAM-1可以很好地介导PMN与VEC黏附，促使PMN凋亡延迟并分泌更多的有害物质，从而加速VEC凋亡。本文从细胞水平为重叠综合征所致血管内皮损伤提供了理论依据。