低氧阈刺激促进神经干细胞增殖分化

赵勇亮 安国斌 侯春波 杨瑞瑞

山东第一医科大学（山东省医学科学院）临床与基础医学院，山东 济南 250117

中枢神经损伤会降低患者的生活质量，目前主要的治疗手段是药物治疗、外科介入及康复训练，但治疗难度较大，疗效有限。中枢神经损伤后的修复治疗一直是临床工作面临的重大难题之一，需要进一步探索促进中枢神经损伤后修复的方法。近年来，国内外对神经干细胞（neural stem cells，NSC）的培养、生物特性、临床应用进行了一定研究并取得了相应成果。NSC 是中枢神经系统内处于未分化状态的母细胞，具有自我分裂及更新的能力，并能向多方向进行分化。NSC 可以促进中枢神经损伤修复，特别是外源性NSC 移植，已在临床中枢神经损伤修复中得到广泛研究。低氧作为外源性刺激因子，可激活机体内源性保护机制，促进NSC 的增殖，参与中枢神经损伤后的修复过程［1］。低氧有利于神经干细胞微环境的构建，并且对中枢神经系统损伤后神经元的再生及修复具有重要作用［2］。低氧阈刺激即在体外低氧环境诱导下刺激NSC 增殖分化。作为无创性治疗方法，低氧阈刺激安全且易在临床中实现，故探索中枢神经损伤后低氧阈刺激对运动功能恢复的影响具有重要意义。

1 低氧处理有助于NSC的增殖分化

低氧处理后，中枢神经系统中的NSC相较于常氧下，增殖数量有明显提升［3］，并且低氧处理有效地促进了NSC的分化［4］。而低氧本身作为胚胎发育和脑组织间隙的正常环境，是NSC增殖分化中的生理性刺激因素，体外培养NSC 则可利用低氧维持NSC干细胞特性的作用，从而触发人中枢神经系统神经元的发生［5］。但中枢神经损伤后，其自发性的修复尚不能完全恢复神经功能，低氧则可以在中枢神经系统修复的基础上进一步刺激并增强内源性恢复程度。目前发现低氧不仅可以作为NSC 增殖分化的直接刺激因素，还能够上调神经细胞内的低氧敏感性生长营养因子水平，不仅起到保护神经的作用，还能增加神经的可塑性，调节突触与相关的信号通路，在神经系统损伤后对功能恢复起到重要作用。此外，低氧可以增加脑组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，促进血管新生，对中枢神经系统损伤起保护作用。

2 低氧阈刺激对NSC增殖分化的作用

2.1 RNA结合蛋白RBM3在低氧下促进NSC增殖

RNA 结合蛋白RBM3 在低氧条件下促进NSC增殖［6］，调控RBM3的表达为增加培养的NSC活力、增殖能力和多效性开辟了一条新途径，这可能会提高移植后的治疗效果。RBM3在低氧缺血性脑损伤后通过IMP2-IGF2信号通路以生态依赖性方式促进神经发生［7］。

2.2 代谢性谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor，MGluR）发挥调节作用

MGluR 是结合谷氨酸并通过G 蛋白影响第二信使系统的细胞表面蛋白。有报道称，低氧调节增殖的NSC 中，MGluR 的表达增多，而由低氧诱导的MGluR 的表达可能是低氧刺激NSC 活化的机制之一［8］，MGluR5参与暴露于低氧状态的大鼠神经祖细胞的增殖。研究表明，在体外低氧刺激大鼠神经祖细胞的增殖过程中，MGluR5的表达被上调［9］。NSC是自我更新的多能细胞，可分化为神经系统的主要表型（包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）。神经祖细胞（neural progenitor cells，NPCs）是干细胞分裂的后代，可以在有限分裂后开始分化为各种类型的细胞。低氧阈刺激下MGluR 表达水平提高，提示其亚型可能在低氧诱导的NSC增殖分化中发挥重要的调节作用。

2.3 低氧时可见HIF-1α的表达增多

HIF-1 是由α 和β 亚基构成的异二聚体转录因子，而HIF-1α在低氧状态下表达增多并且理化性质较常氧下更加稳定。相较于其他生物活性因子〚如诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），HIF-1α 表达增加促进NSC 增殖、抑制其凋亡的作用要显著高于iNOS［10］。作为重要的生物活性因子，HIF-1α的作用很多。

2.3.1 促使VEGF 和VEGF 受体表达增加，诱导新生血管形成 内皮细胞可以通过VEGF分泌促进低氧条件下的NSC增殖［11］。HIF-1α可以诱导VEGF表达增多，轻中度或者短期内的低氧阈刺激下可以使HIF-1α 更加稳定，进而引起VEGF 等具有保护神经系统功能的靶基因表达增多。而VEGF本身可以动员新生血管细胞的形成，增加低氧部分的血液供应，为NSC 提供更多的能量与生物活性因子，促进NSC的增殖，特异性表达VEGF 的NSC 可用于治疗神经性疼痛以及损伤修复［12-13］。

2.3.2 促进葡萄糖转运蛋白1 型（glucose transporter type 1，GLUT-1）和糖酵解酶等表达，增加细胞摄取葡萄糖 GLUT-1 是一种普遍表达的葡萄糖转运蛋白，主要在血脑屏障的内皮细胞和红细胞中表达，并负责转运葡萄糖进入大脑，而低氧时，NSC 增殖的过程是由于HIF-1α 上调使得NSC 受刺激后增加了葡萄糖摄入从而完成增殖。低氧增加了大鼠脑内NSC 的细胞活力，而对于NSC 来说，低氧属于一种高刺激的环境，只有当缺乏葡萄糖时，NSC 才会凋亡。低氧阈刺激下，NSC 培养基中葡萄糖含量明显降低，而其通过糖酵解消耗更多的葡萄糖来产生能量。但并非葡萄糖含量越高就意味着NSC 增殖能力越强，相反，相比于低氧高糖的环境下，NSC 更倾向于低氧低糖的条件下生长，并通过糖酵解维持其自我更新增殖的能力。

2.3.3 诱导脑源性促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）生成 脑源性EPO 与血源性EPO 比较产生的量少，但具有更高的活性。EPO 是一种糖蛋白激素，主要由成人的肾脏和胎儿的肝脏分泌，作用于骨髓的红系干细胞以刺激其增殖和分化，其可以调节红细胞的产生和VEGF 的表达从而触发新血管形成和GLUT-1 的增多，促进细胞摄取葡萄糖［14］。

2.3.4 调控miR-210 表达 一些ncRNAs 参与了低氧阈刺激下NSC增殖的调节，其中miR-210表达水平在低氧条件下增加［15］。其启动子区有保守的HIF-1α调控元件，证明其受HIF-1α的调控。此外，低水平分泌型miR-210仅略微增加了神经祖细胞的细胞活力，相比之下，高水平分泌型miR-210表现出对细胞活力的抑制作用。总之，低氧增加了外泌体中miR-210的分泌，并对受体NPC 的细胞活力表现出不同的影响。

2.3.5 低氧通过miR-21促进NSC的增殖 miR-21的表达可以促进NSC的增殖，若降低miR-21的浓度可以抑制NSC的增殖［16］。研究发现，在低氧（3%）条件下，NSC 在对照组高表达miR-21，在常氧组表达有所降低，但在0.3%低氧条件下miR-21 的表达明显高于前两组，这些都提示miR-21在NSC的增殖中起调节作用［17］。

2.3.6 HIF1-α 的稳定有助于NSCs 保持其增殖分化的能力 HIF1-α 的稳定性受脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）的调节，其活性主要受PHD底物如氧（O2）、α-酮戊二酸（α-KG）以及辅助因子抗坏血酸（ascorbic acid，ASC）和亚铁（Fe2+）所影响。由此可见，HIF-1α 的转录活性实际上是由O2、α-KG、ASC 和Fe2+的含量决定的，在低氧状态下，PHDs 的活性受到低O2的抑制，可以稳定HIF1-α 水平。因此，在常氧条件下抑制PHD 活性，模拟低氧的作用，有利于保持NSCs 的干细胞增殖分化的能力［18］。但针对低氧刺激NSC分化还是增殖上，有不同的观点。

低氧可以刺激NSC 分化增加，在体外培养NSC中起促进神经元分化的作用［19］。实验证明，在低氧处理大鼠脑组织后，受影响的半球脑室下区域存在强烈的增殖反应，而通过与对照组比较，发现受低氧处理的半球脑室下区域产生3 倍的神经元，而少突胶质细胞则多出2倍。低氧阈刺激对于调节神经分化至关重要，并显示出对NSC 分化的不同影响，这取决于NSC发育的时间进程。在低氧诱导早期，低氧抑制神经分化，维持未分化状态；而在低氧诱导后期，低氧诱导神经分化［20］。

低氧阈刺激对NSC 的增殖起促进作用而分化并未表现出来。研究表明，在低氧气（1%）供应下，不会影响NSC 的体外活力与增殖，即便NSC 或者NPCs 能够在低氧刺激下的成年小鼠脑组织存活并增殖，但其并未分化成神经元［21］。除此之外，前文提到的HIF-1α在低氧阈刺激下表达增多，其可以通过激活Hes1防止NSC过早分化［22］，这与上文的实验结果有差异。说明低氧阈刺激可以在促进NSC 增殖的同时，抑制其早期分化，但关于二者是否存在明显的差别，目前仍有争论。

2.4 低氧通过其他信号通路促进NSC的增殖

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是由氧的不完全单电子还原形成的分子或离子，它们有助于巨噬细胞发挥效应，调节信号转导和基因表达，并可以对核酸发生氧化损伤。而在低氧阈刺激NSC增殖中，ROS 可以通过PI3K/Akt 信号通路介导NSC的增殖和分化［23］。星形胶质细胞（astrocytes）形状不规则，具有许多长突起，它们形成神经胶质膜并直接或间接地形成血脑屏障。在低氧阈刺激下，星形胶质细胞被激活并通过PI3K/Akt 信号通路促进NSC 增殖［24］。提示PI3K/Akt 信号通路参与低氧阈刺激时NSC 的增殖，在此当中发挥作用。研究发现，体外低氧通过活化大鼠NSC中的c-Jun N末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）来增加细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表达，提示低氧诱导的NSC 增殖的可能机制［25］。此外，体外轻度低氧也可促进海马衍生的NSC 增殖和神经元分化。轻度低氧增强了Notch1 和Hes1 表达，表明Notch1 信号可能参与低氧条件下的神经保护。

Wnt 蛋白是一大类分泌性糖蛋白，在胚胎和胎儿发育以及组织维持中发挥重要作用。β连环蛋白（β-catenin）是一种参与细胞粘附和核信号传导的多功能连环蛋白，它可以充当Wnt蛋白介导的信号转导通路的转录共激活剂和下游组件。Wnt/β-catenin信号传导通过影响细胞周期来调节细胞的增殖，而低氧通过增加HIF-1α 的表达并激活Wnt/β-catenin信号通路来刺激NSC 增殖［26］，并通过MFN2 诱导神经干细胞分化［27］。研究发现，体外低氧培养下，NSC增殖增加且其β-catenin 表达增加，表明Wnt/βcatenin 信号通路具有促进低氧诱导NSC 增殖的作用［28-29］。 基 质 金 属 蛋 白 酶 -9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是Wnt 激活后的下游关键分子效应物，在低氧刺激NSC 增殖中发挥效应［30］。

2.5 低氧预适应增强Bcl-2 的表达并且抑制caspase-3 的表达，有助于提升NSC的抗低氧能力

B细胞白血病/淋巴瘤-2基因（Bcl-2），负责阻止正常细胞的凋亡，并在过度表达时与滤泡性淋巴瘤相关。caspase-3是一种短的前域半胱天冬酶，在细胞凋亡中起效应作用。经历过低氧预适应后，NSC可以提高对低氧损伤的抵抗力，这些在将来复氧后NSC 增殖活性提升起不可取代的作用。研究表明，低氧预适应可以增加脑组织内Bcl-2的表达并且可以抑制caspase-3的表达，从而抑制细胞凋亡。低氧预适应增强小鼠脑出血后NSC移植治疗［31］，这样的处理方式为体外培养NSC 提供方法基础。同样的研究还可见低氧预处理策略保护大鼠神经细胞，改善大鼠脊髓损伤后的修复，因此可作为治疗大鼠脊髓损伤的有效且可行的策略［32］。这些可以为临床治疗脑卒中提供理论基础。

3 不同的低氧浓度刺激下NSC的增殖

多项研究均表明，低氧阈刺激可促进NSC的增殖，但关于具体的低氧阈刺激浓度却莫衷一是。有研究发现，3%的低氧环境下，NPCs 可以维持其活性，在此浓度下对其低氧预适应并移植发现，3%的低氧预适应增加NPCs 的增殖活性，其存活率是对照组的2 倍［33］，这样通过低氧来增强细胞抗低氧能力的研究与前文研究结果一致。但多数研究以2%～5%的低氧刺激作为实验组，有报道称，大脑皮层NSC增殖分化的最佳浓度和时间窗为5%氧预处理72 h［34］；若以20%的常氧作为对照组，发现实验组经过低氧阈刺激后，NSC 增殖明显提升，细胞增殖数量较对照组增多，并且可以有效提高NSC的增殖速度，但1%的低氧刺激NSC 并未表现出更高的增殖速度［35］，说明在一定程度的低氧范围内，对NSC 的增殖促进具有最大效应，而一旦超过此范围，增殖的促进效应降低甚至可能会转变为抑制效应。

4 结 论

低氧阈刺激下，可以促进NSC 的增殖分化，此外在低氧预适应后，NSC 的抗低氧损伤能力提升，并在未来移植或者复氧后表现为更强的增殖活性。尽管有众多的潜在机制为低氧阈刺激促进NSC 的增殖分化提供理论依据，但针对其详细机制仍有待进一步研究。

NSC 作为各种中枢神经系统损伤修复过程中的种子细胞，其增殖与分化在此过程中扮演着不可取代的角色，目前在低氧阈刺激下NSC的增殖和分化机制研究并不充分。而众多研究表明，低氧阈刺激可能成为NSC体外扩增的可行手段，在未来的实验研究和临床应用中有着广阔的前景。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突