不同低氧暴露时间对小鼠骨骼肌ERRα/PDK4调节的影响

2014-08-07 12:07何诗依孙海洋
体育科学 2014年2期
关键词:低氧骨骼肌有氧

何诗依,陈 婷,孙海洋,张 缨

不同低氧暴露时间对小鼠骨骼肌ERRα/PDK4调节的影响

何诗依1,陈 婷2,孙海洋1,张 缨1

目的:研究不同低氧暴露时间对小鼠骨骼肌雌激素受体相关受体(estrogen receptor related receptors α,ERRα)与丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)DNA结合活性及PDK4基因表达的影响,以探讨低氧条件下影响糖代谢及其信号分子之间的相互调节可能的机制。方法:野生小鼠随机分为常氧组、低氧组(氧浓度11.25%左右,模拟海拔高度4 500 m),而后又进一步分为0天、7天、14天、28天组,每组10只。低氧暴露时间为每天8 h。同天数的小鼠常氧组与低氧组脱颈处死。染色质免疫共沉淀法(Chip)测定ERRα/PDK4结合活性,Real-Time PCR测定骨骼肌PDK4 mRNA含量。结果:1)随着天数增加,低氧组ERRα/PDK4的结合活性有增加的趋势,但没有显著性差异;2)随着天数增加,低氧28天组PDK4 mRNA相对表达量与0天组相比显著性升高(P<0.05),且与28天常氧组相比也有显著性增加(P<0.05)。结论:低氧28天小鼠骨骼肌PDK4 mRNA相对表达量显著增加,但其ERRα/PDK4的结合活性并没有显著性变化,推测低氧下ERRα并不是促进PDK4 mRNA表达的主要转录因子。

雌激素受体相关受体;丙酮酸脱氢酶激酶4;低氧

低氧暴露是低氧训练的一个重要组成成分,骨骼肌的糖代谢与低氧适应关系密切[1]。然而,低氧是如何影响糖代谢及其信号分子之间的相互调节机制,目前并不十分清楚。

有研究报道,在低氧下可激活低氧诱导因子-1α(HIF-1α),进而通过提高糖酵解酶的活性来提高ATP的产量[6]。骨骼肌葡萄糖代谢中丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isoform 1,PDK1)是HIF-1α转录的靶基因[4],PDK1能够抑制葡萄糖有氧氧化的关键限速酶——丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)催化丙酮酸生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环有氧氧化[4]。因此,低氧下HIF-1α除了直接增强糖酵解代谢酶活性外,还通过PDK1间接抑制葡萄糖有氧氧化的关键酶PDC的活性,从而促进低氧下葡萄糖的糖酵解供能,进行糖代谢的低氧适应。

近年来发现, ERRα对能量代谢有调节作用[3]。有研究表明,HIF-ERR两种蛋白能够相互作用,在缺氧的代谢适应中HIF可能与能量代谢重要调节器ERRs有关[2]。研究发现,PDK4是ERRα转录因子的靶基因[11]。作为PDK1同工酶的PDK4,在糖代谢中有着与PDK1同样的作用。因此推测,在低氧刺激下除HIF-1α/PDK1通路抑制葡萄糖的有氧代谢外,可能还存在着 HIF-1α-ERRα/PDK4这样一条分子信号传导通路,共同调节骨骼肌糖代谢的有氧/无氧进程,以达到低氧适应目的。

本实验试图通过不同低氧暴露时间,探讨ERRα对PDK4转录活性以及PDK4 mRNA的影响,从而确定ERRα/PDK4调控在小鼠骨骼肌糖代谢低氧适应中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验对象与方案

1.1.1 实验动物及饲养方式

健康5~6周龄C57BL/6J野生(Wild-type,WT)小鼠,体重18±2 g,在北京体育大学动物饲养房中分笼正常饲养,每笼3~4只。

1.1.2 实验分组

将C57BL/6J野生小鼠随机分为常氧组和低氧组,而后又进一步分为0天、7天、14天、28天组,每组10只。常氧组小鼠在常氧下正常笼中生活,低氧组小鼠在常压低氧环境下正常笼中生活,每天8 h低氧暴露于北京体育大学低氧房中(模拟海拔高度4 500 m,氧浓度11.25%左右)。

1.1.3 取材

同天数的小鼠常氧组与低氧组脱颈处死,立即取两侧小腿骨骼肌后迅速称量,并在-80℃低温冰箱保存。

1.2 实验指标的测定

1.2.1 PDK4 mRNA表达的测定

1.总RNA的提取:取小鼠骨骼肌50 mg,加入0.8 ml Trizol试剂(Invitrogen)先后经过分相、分离RNA、洗涤RNA和再悬浮RNA;

2.逆转录cDNA:利用PCR扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司,MG96+/Y)和RT-PCR试剂盒(Toyobo,FSQ101)进行逆转录反应,之后在-20℃冻存。

3.实时荧光相对定量PCR:采用美国ABI 7500荧光定量PCR仪和Toyobo公司生产的荧光染料反应体系(SYBR Green Realtime PCR Master Mix),以及PDK4引物 (QIAGEN,QT00157248)和18rRNA引物(QIAGEN,QT00157248)。反应体系包括:SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μl,引物2 μl,CDNA模版2 μl,ddH2O 6 μl。目的基因表达结果用比较CT法相对定量,目的基因=2-△△CT。

1.2.2 ERRα/PDK4 DNA结合活性测定

ERRα和PDK4活性采用染色质免疫沉淀法(CHIP),具体步骤:

1.提取核蛋白并测定浓度,调整总蛋白一致,分为IP样品管和Input的对照管;用IP buffer补足IP管体积至1.5 ml;加入10 μl ERRα抗体,4℃过夜。

2.加入40 μl Protein A/G plus-agarose,2 μl 鲱鱼精DNA,4℃ 1.5 h摇床;沉淀抗体识别的蛋白或相应的复合物, 2 500 rpm 1 min,弃上清液,沉淀用IP buffer 洗涤3 次,IP washing buffer 4次洗涤,150 μl elution buffer 震荡10 min,4℃ 14 000 rpm 3 min,取上清液( 含抗体/蛋白/ DNA 复合物),重复1 次,合并上清液(共300 μl);300 μl上清液中加入18 μl 5M NaCl, 65℃加热4.5 h,去除蛋白和基因组DNA之间的交联;用IP elution buffer补足Input对照至300 μl,同样加入18 μl 5M NaCl, 65℃加热4.5 h,去除蛋白和基因组DNA之间的交联;800 μl无水乙醇,-20℃沉淀过夜。

3.4℃ 14 000 rpm 20 min,弃上清液,1 ml 70% 乙醇洗涤沉淀,4℃ 14 000 rpm 10 min,弃上清,风干10 min;100 μl TE buffer,加入11 μl Proteinase K buffer,1 μl蛋白酶K,55℃孵育1 h;加入290 μl TE 混匀后,加入400 μl 苯酚-氯仿-异戊醇,震荡1 min,14 000 rpm 1 min;取上清液,并加入40 μl 3M NaAC,0.25 μl肌糖元,750 μl无水乙醇,-20℃沉淀过夜。

4.4℃ 14 000 rpm 20 min,弃上清液,1 ml 70%乙醇洗涤沉淀,4℃ 14 000 rpm 10 min,弃上清液,风干沉淀,加16 μl去核酶水沉淀,用于PCR检测。

5.实时荧光相对定量PCR:采用美国ABI 7500荧光定量PCR仪和Toyobo公司生产的荧光染料反应体系(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)和PDK4引物。

根据文献设计引物(此引物由上海生物工程有限公司合成)以扩增转录因子ERRα与PDK4启动子结合位点(TCAATGTCA)的片段(表1)[10]。

PCR分别扩增IP样本、IgG对照样本和Input样本,并用1%琼脂糖凝胶分别检验扩增效果。目的基因表达结果用比较CT法相对定量,目的基因=2-△△CT。

1.3 数据统计

2 实验结果

2.1 不同低氧暴露时间对小鼠骨骼肌ERRα /PDK4 DNA结合活性的影响

同天数的低氧组与常氧组相比,ERRα/PDK4 DNA的结合活性有增加的趋势,但无显著性差异(图1、图2)。

图 1 本研究ERRα/PDK4 DNA 结合活性PCR扩增效果图

图 2 本研究不同时间低氧对小鼠骨骼肌ERRα/PDK4 DNA结合活性影响示意图

2.2 不同低氧时间对小鼠骨骼肌PDK4 mRNA表达的影响

与0天组相比,低氧28天组小鼠PDK4 mRNA相对表达量有显著性的升高(P<0.05);28天低氧组与其常氧组相比,PDK4 mRNA的相对表达量显著性升高(P<0.05,图3)。

3 分析与讨论

低氧条件可刺激机体产生HIF-1α,HIF-1α作为转录因子能诱导其一系列靶基因转录,促进靶基因mRNA水平增加,进而进一步参与机体进行低氧适应[9]。

图 3 本研究不同低氧暴露时间对小鼠骨骼肌PDK4 mRNA相对表达量图

PDK1作为HIF的靶基因,可磷酸化催化糖代谢中间产物丙酮酸转化为乙酰辅酶A的关键酶——PDC,使之失去活性,抑制糖的有氧氧化途径[4]。在低氧条件下,HIF-1通过提高PDK1的活性,降低有氧氧化进程,从而促使糖酵解反应速率的加快[7]。研究发现,低氧条件下人类肾脏癌细胞系中的HIF-1α能够和PDK1基因的启动子直接结合,促进PDK1 DNA的转录。敲除HIF-1α之后,低氧下PDK1的转录水平相对于常氧下无变化[12]。PDK4作为PDK1的同工酶,对于PDC有着同样的抑制作用。在Zhong L等人[12]的实验中发现,在SIRT6缺陷小鼠(SIRT6可以作为HIF-1α辅阻遏物)HIF-1α活性升高,使得PDK1和PDK4的表达量均升高,这一现象间接地表明HIF-1α也能够调节PDK4。本实验结果也发现,随着低氧暴露时间的延长,28天的间接性低氧暴露可促进小鼠骨骼肌中PDK4的mRNA表达。因而,低氧下PDK4表达的增加可抑制PDC活性,节省氧,从而降低糖的有氧氧化,并进一步提高糖酵解途径,使机体骨骼肌糖代谢达到低氧适应。

雌激素相关受体(ERRs)作为对能量代谢调节有着十分重要作用的转录因子[8],有ERRα、ERRβ和ERRγ 3种亚型。有研究发现,HIF-ERR两种蛋白能够相互作用,而且ERRs能够促进HIF的转录[2]。同时,在Lee J H[5]的实验中发现,低氧下ERRγ的转录活性升高,且采用干扰RNA降低HIF-1α的表达后,低氧下ERRγ转录活性受到抑制。接着他们在ERRγ的启动子上找到了与HIF-1α结合的两个位点,并观察到如果ERRγ的这两个结合位点发生突变,低氧下HIF-1α将不能作用于ERRγ。最后,他们又通过CHIP实验表明,低氧下HIF-1α对ERRγ转录活性有调节作用。Lee J H的以上实验结果证实,低氧下HIF-1α可直接调节ERRγ DNA 的转录。

此外,Lee J H[5]的实验中还发现,ERRγ的过表达会提高PDK4的表达;低氧下ERRγ与PDK4 DNA的结合活性显著性增加。如果低氧下HepG2细胞中降低ERRγ表达,并没有完全抑制对PDK4 DNA的转录,提示,可能存在ERRα转录活性的代偿作用[5]。ERRs的3种亚型具有高度序列一致性,能够调控同一种目的基因[3]。文献已报道,PDK4是ERRs转录因子的靶基因[11]。在小鼠的肝脏癌细胞中,ERRα和ERRγ能够促进PDK4的表达,并且在PDK4启动子375/-330区域有ERRs的结合位点[11]。

关于低氧下ERRα是否调节PDK4的转录活性的在体实验,至今国内、外报道较少。本实验通过对小鼠不同时间低氧暴露,采用CHIP方法观察野生鼠骨骼肌ERRα/PDK4 DNA转录活性,发现随着低氧暴露时间的延长,小鼠骨骼肌的ERRα/PDK4 DNA结合活性有增加的趋势,但没有显著性差异。同时,对小鼠骨骼肌PDK4 mRNA的RT-PCR分析表明,低氧28天骨骼肌PDK4的mRNA活性显著性增加。说明不同时间的低氧暴露,ERRα不是骨骼肌PDK4转录的主要调节者。推测低氧下ERRγ可能对骨骼肌PDK4基因转录有着重要的调节作用。

4 结论

低氧28天小鼠骨骼肌PDK4 mRNA相对表达量显著增加,但其ERRα / PDK4的结合活性并没有显著性变化,推测低氧下ERRα并不是促进PDK4 mRNA表达的主要转录因子。

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EffectsofHypoxiawithDifferentTimeonRegulationsofERRαBindingtothePDK4PromoterinSkeletalMuscleofMice

HE Shi-yi1,CHEN Ting2,SUN Hai-yang1,ZHANG Ying1

Objective:Different time hypoxic exposure inducing ERRα binding to the PDK4 promoter and PDK4 mRNA expression was investigated,which is to discuss the possible mechanism of carbohydrate metabolism and regulations among signal molecules under hypoxic conditions.Methods:Wild-type C57BL/6J mice were subjected to either normoxia or hypoxia.Mice in the hypoxia groups were exposed to a hypobaric chamber that replicated the hypobaric hypoxia conditions found at 4 500m altitude for 8 hours a day.And then each group with 10 mice is also randomly based on the different days(0,7,14,28).Mice of the normoxic and hypoxic groups in the same days were sacrificed.Performing CHIP assay to confirm the hypoxia treated regulation of ERRα on PDK4 promoter.PDK4 mRNA was measured by Real Time-PCR.Results:1) When hypoxia exposed for 14 days and 28 days,ERRα recruitment on PDK4 promoter trends to elevate but has no significance;2) Comparing with 0 day groups and normoxia 28 days group,hypoxia 28 days group’s PDK4 mRNA was significantly increased (P<0.05).Conclusion:Under 28 days’ exposure of hypoxia,PDK4 mRNA was significantly increased in mice skeletal;muscles,but the ERRα recruitment on PDK4 promoter has no significant augment.So,we conjecture ERRα as a compensatory transcription control mechanism to PDK4.

ERRα;PDK4;hypoxia

1000-677X(2014)02-0075-04

2013-05-06;

:2013-10-25

国家自然科学基金资助项目(31171140);全国大学生创新创业训练计划项目。

何诗依(1992-),女,湖南益阳人,主要研究方向为运动生物化学, E-mail:hsyiyi@126.com;张缨(1961-),女,北京人,教授,博士,博士研究生导师,主要研究方向为运动和骨骼肌代谢,Tel:(010)62989584,E-mail:zhyi9256@126.com。

1.北京体育大学 运动人体科学学院,北京 100084;2.杨百翰大学 生理和发展生物学,美国犹他州,普罗佛84602 1.Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Brigham Young University,Provo 84602,USA.

G804.7

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