YKL-40 RNA 干扰对载脂蛋白E 基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响

张辉 周文平 刘刚琼 张文静 张金盈

1郑州大学第一附属医院心内科（郑州450052）；2郑州大学第三附属医院心内科（郑州450052）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）进程中存在YKL-40 高表达［1］。本研究探讨YKL-40 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）对载脂蛋白E 基因敲除小鼠（apolipoprotein E-deficient mice，apoE-/-小鼠）颈动脉AS 斑块的影响。

1 材料与方法

1.1 材料YKL-40 shRNA慢病毒载体目的基因序列为：5′-GCTCCAGTGCTGCTCTGCATA-3′。12 周龄雄性apoE-/-小鼠72 只，购自北京大学医学部，均采用高脂喂养。Trizol 试剂购自美国GIBCO 公司；油红O、单核细胞趋化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）及脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein associated phospholipase A2，Lp-PLA2）等ELISA 试剂盒购自郑州森斯科贸生物制品有限公司。所有动物实验均经郑州大学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠AS 模型的建立及动物分组本研究采用左颈总动脉缩窄性套管法诱导AS 形成并建立apoE-/-小鼠AS 模型［2-3］：麻醉满意后apoE-/-小鼠颈正中切口，分离左颈总动脉，在动脉上套扎长3 mm 内径0.3 mm 的硅胶套管并固定［2-3］，术后缝合切口，继续高脂喂养。8 周后apoE-/-小鼠随机分为对照组（n = 24），病毒阴性对照（negative control，NC，n = 24）组和观察组（n = 24），再次分离左颈总动脉，去除硅胶套管并分别局部滴注生理盐水、阴性对照病毒（5 × 107TU）、YKL-40 RNA 干扰慢病毒（5×107TU）。6 周后收集斑块制作6 μm冰冻切片采用HE 和油红O 染色并进行病理组织学分析。

1.2.2 血浆MCP-1、Lp-PLA2及血脂水平测定小鼠麻醉后取血，离心后取上层血浆检测，测定Lp-PLA2、MCP-1、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）及总胆固醇（total cholesterol，TC）、水平。

1.2.3 组织形态学检测使用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件对HE 染色及油红O 染色切片进行定量分析，检测斑块面积、纤维帽厚度及脂质含量。

1.3 统计学方法本研究采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析，所有计量资料以均数± 标准差表示，正态性检验后进行单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用Student-Newman-Keuls（SNK）检验，P ＜0.05认为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 各组间体质量和LDL-C、HDL-C、TC 及TG水平比较对照组、NC 组与观察组小鼠相比，体质量差异无统计学意义（P＞0.05），且没有小鼠在慢病毒转染后死亡，说明本实验以及慢病毒转染是安全的。另外，各组间LDL-C、HDL-C、TC 及TG 水平差异无统计学意义（均P＞0.05，表1）。

2.2 YKL-40 RNAi 对AS 斑块形态及组分的影响对照组、NC 组与观察组小鼠AS 斑块纤维帽厚度分别为（9.14 ± 0.84）、（9.22 ± 0.91）、（13.15 ±1.21）μm，观察组斑块纤维帽厚度明显高于对照组和NC组（P ＜0.05）。对照组、NC组与观察组斑块面积分别为（6.21 × 104）、（6.17 × 104）、（4.76 ×104）μm2，观察组斑块面积明显低于对照组和NC 组（P ＜0.05）。对照组、NC 组与观察组斑块脂质含量分别为30.14%、29.73%、22.95%，观察组斑块脂质含量明显低于对照组和NC 组（P ＜0.05，图1）。对照组与NC 组相比脂质含量、纤维帽厚度及斑块面积均无显著性差异，这表明观察组得出的有益作用并非由病毒侵染所导致的非特异性免疫应答所引起，进一步证实了RNAi 的干扰有效。

表1 各组小鼠体质量和血脂水平Tab.1 Body weight and plasma lipid levels among all groups ±s

表1 各组小鼠体质量和血脂水平Tab.1 Body weight and plasma lipid levels among all groups ±s

注：组间比较采用方差分析，*P＞0.05

体质量（g）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）对照组28.44±3.73 29.11±4.68 3.05±0.52 25.74±2.58 2.69±0.82 NC 组29.32±3.71*29.85±4.97*3.23±0.51*25.22±2.44*2.62±0.79*观察组29.15±3.66*30.32±4.56*3.17±0.58*25.50±2.51*2.65±0.88*

2.3 YKL-40 RNAi 对血浆炎症因子Lp-PLA2及MCP-1 水平的影响与对照组和NC 组小鼠相比，观察组血浆炎症因子Lp-PLA2及MCP-1 水平明显降低，这说明YKL-40 RNAi 治疗可降低炎症因子Lp-PLA2及MCP-1 的水平（P ＜0.05）；另外对照组与NC 组相比，Lp-PLA2及MCP-1 水平差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 各组组炎症因子水平Tab.2 The expression of inflammatory cytokines in the each group ±s

表2 各组组炎症因子水平Tab.2 The expression of inflammatory cytokines in the each group ±s

注：组间方差分析，*P ＜0.05；与对照组相比，▲P ＞0.05

Lp-PLA2（μg/L）MCP-1（μg/L）对照组131.28±14.55 13.56±1.38 NC 组133.68±14.21▲13.99±1.43▲观察组79.88±9.26*8.62±0.95*

3 讨论

AS 是一个复杂的的病理生理学进程，在冠心病及其并发症的发生发展过程中发挥重要作用。目前普遍认为AS 是一种炎症性疾病［3-4］，YKL-40是一种新的AS 危险因子和炎症的标记物，可由斑块局部活化的巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞分泌［5-7］。AS 进程中存在YKL-40 高表达，YKL-40 在AS 的发生和发展过程中发挥重要作用［8-9］。研究发现YKL-40 与内皮功能紊乱及斑块不稳定性相关［9］。YKL-40 在炎症、细胞外基质重构、细胞增殖及血管发生中发挥重要作用［8］。研究［8-9］显示，YKL-40 水平升高与冠状动脉及脑血管事件的发生相关，且YKL-40 水平增加与冠状动脉病变进展相关。

图1 对照组、NC 组与观察组的斑块形态学分析Fig.1 Plaque morphology of the control，NC and treatment groups

抑制AS 炎症因子及基因治疗是未来治疗AS的新途径［2］。已证实RNA 干扰可以高效特异性地抑制靶基因的表达［3］。慢病毒载体具有转染效率高，持续时间长，安全、有效等特点［3］。本研究首先构建apoE-/-小鼠AS 模型，然后合成针对YKL-40的慢病毒载体并对apoE-/-小鼠颈动脉斑块进行慢病毒转染，降低YKL-40 的表达，观察YKL-40 RNA干扰对病变局部脂质含量、纤维帽厚度以及斑块面积的影响，并进一步观察Lp-PLA2以及MCP-1 等炎症基因表达水平的变化。

本研究表明，YKL-40 RNA 干扰可以降低apoE-/-小鼠促炎因子Lp-PLA2及MCP-1 的水平，降低斑块脂质含量，减少斑块面积并增加纤维帽厚度，这说明YKL-40 RNA 干扰后AS 斑块稳定性升高。研究［10］表明不稳定斑块是主要心血管事件及脑卒事件发生的主要原因。本研究表明，YKL-40 RNA 干扰可以降低炎症基因的表达，增高斑块纤维帽厚度，降低斑块脂质含量，小鼠颈动脉斑块稳定性升高，易损性降低，进一步证实了YKL-40 RNA 干扰治疗AS 的有效性。

炎症反应在AS 的发生发展以及斑块失稳定和破裂过程中发挥着关键作用。Lp-PLA2及MCP-1是AS 进程中重要的炎症因子，Lp-PLA2可水解氧化磷脂生成溶血磷脂胆碱和氧化非酯化脂肪酸［11］，这些水解产物都具有强大的促炎作用和致AS 作用，可促进引起单核细胞聚集、内皮功能紊乱并促进动脉管壁以及斑块局部慢性炎症的发生和发展［12-13］。故Lp-PLA2是可导致斑块失稳定，斑块破裂和临床心脑血管事件的发生［14-15］。MCP-1 可促进单核巨噬细胞在AS 斑块部位聚集，并介导对单核细胞及炎症细胞的迁移和活化。因此，本研究结果进一步表明，YKL-40 RNA 干扰通过降低Lp-PLA2 及MCP-1 等炎症因子的水平，降低斑块脂质含量并降低斑块易损性。

此外，笔者排除了本研究的有益结果来自于病毒非特异性免疫反应的可能性，因为对照组与NC 组相比，各参数间均无统计学差异。AS 过程中YKL-40 等炎症因子表达增加。抑制AS 的炎症因子是未来治疗AS 的新途径［2，15］。因此，慢病毒介导的YKL-40 RNA 干扰提供了一种安全，有效的治疗AS 的方法。

本研究结果表明，YKL-40 RNA 干扰可降低小鼠YKL-40 水平，进而降低Lp-PLA2及MCP-1 等炎症因子水平，进而降低斑块脂质含量并降低斑块易损性，这些有益作用是独立于降脂作用之外的。因此，慢病毒介导的YKL-40 RNA 干扰提供了一个治疗AS 的新途径。