鼠脑胶质瘤瘤周水肿组织磁共振灌注成像参数与水通道蛋白-1 的相关性

袁园 李香营 谈顺 陈建强 杨光 陈晶

中南大学湘雅海口医院（海口市人民医院）1放射科，2中心实验室，3病理科（海口570208）

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，血管新生是其生长的先决条件，并对肿瘤细胞的浸润和转移起着非常重要的作用［1］，研究显示胶质瘤瘤体与瘤周组织新生血管活性不同，瘤周新生血管较肿瘤内部的血管活性更高，这为进一步研究肿瘤的生物学特性明确了方向［2］。磁共振灌注成像（perfusion weighted imaging，PWI）是一种功能磁共振成像技术，其优势在于通过灌注成像参数间接反映肿瘤新生血管数量和质量（血管完整性和微血管通透性等），尤其是近几年已然成为分子影像研究肿瘤血流动力学的重要工具［3-5］。水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）是能够实现跨膜转运水分子的膜蛋白家族成员之一，其作用通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）促进血管内皮细胞的迁徙移动，进而提高新生肿瘤血管的数量，不过这些新生血管完整性不高，通透性较高。因而研究AQP-1 在胶质瘤瘤周血管新生中表达与局部脑血容量（regional cerebral blood volume，rCBV）、表面血管通透性（permeability surface，PS）的相关性是可行的，并具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和模型制作雌性Wistar大鼠39只，体质量240～325 g，经过适应性饲养后按照随机数字表的方法分成实验组（n = 34 只）和对照组（n=5只）。C6胶质瘤细胞株按照以下具体步骤培养，首先配置细胞生长所需的完全培养基（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液），然后常规传代，培养并通过台盼蓝排斥试验检验C6 胶质瘤细胞的活性，保证细胞活力＞95%，最后计数培养的C6 胶质瘤细胞，要求接种细胞数不低于1 ×106/10 μL。以40 mg/kg 剂量用1%戊巴比妥钠对大鼠行腹腔注射麻醉，俯卧位头部固定于单臂数显脑立体定位仪上，头顶去毛，消毒，切开头皮，用微型手持式颅钻在冠状缝前1 mm，矢状缝右旁开3 mm处钻一骨孔。接种专用10 μL微量注射器将1×106个细胞完全注入硬脑膜下5 mm 处（进硬脑膜下6 mm，退1 mm），注射速率为1 μL/min，注射完毕后静止10 min 后缓慢速退出微量注射器，封闭骨孔，观察接种大鼠生命体征并采用单笼饲养，对照组采用相同的接种方法操作，注射完全培养基［6］。

1.2 MRI 扫描

1.2.1 MRI 扫描技术采用美国通用公司生产的超高场强3.0 T MRI 扫描，线圈为上海晨光公司提供的专用四通道大鼠线圈。所有荷瘤大鼠和对照组大鼠于接种后3～4 周行常规MRI 检查。T1WI TR/TE = 350 ms/19 ms，T2WI TR/TE = 3 000 ms/120 ms，层厚= 3.0 mm，层间距= 0 mm，矩阵192 ×192，FOV = 8 cm × 8 cm。T2 Flair 采用Propeller 技术，具体参数为TR/TE=9 000 ms/155 ms，NEX=1，层厚=3.0 mm，FOV=15 cm×15 cm。

PWI 采用GRE-EPI 序列，TR/TE = 1 000 ms/25 ms，层厚= 3 mm。层间距= 0 mm，FOV = 8 cm× 8 cm，矩阵64 × 96，FA = 10°NEX = 1，定层面获取3 基本图像后经尾静脉注入0.2 mmol/kg 钆喷酸葡胺（Gd-DTPA），注射时＜2 s，采用多层采集方式，每层面共获取50 幅图像。之后行增强T1WI 和T1-3D-Bravo检查，T1-3D-Bravo参数：层厚=0.8 mm，矩阵256 × 256，pre time = 380 ms，FA = 15°，FOV =8 cm×8 cm。

1.2.2 MRI 图像及数据处理利用Function Tool 4.0 工作站对原始图像进行后处理，在经验丰富的神经外科专家和神经影像专家指导下，选取多个等大ROI 取最大血容量作为相应部位的rCBV 值，PS值计算参考国内学者钱银锋等［7］的方法。ROI选择要去除脑脊液、脑室等影响结果的非脑组织。通过T2WI+T2 FLAIR+T1WI增强+T1-3D-bravo容积增强四个扫描序列确定瘤体与瘤周水肿组织。

1.3 病理检查荷瘤大鼠和对照组大鼠在接受MRI 扫描后，采用4%的多聚甲醛灌注固定全脑。以视交叉为参照，将瘤周水肿组织进行切片，制成与PWI 层面位置一致的0.4 μm 厚玻片，HE 染色，光镜下观察接种胶质瘤的WHHO 级别和瘤体边界情况。按照公司提供的说明书进行GFAP、S-100β 和AQP-1 的链霉素抗生物素蛋白一过化物法。AQP-1 以大鼠肾脏标本做阳性对照。AQP-1结果判定参照李香营等［8］方法，计算400 倍光镜下AQP -1 累积光密度（integrated optical density，IOD），以反映每个视野的阳性细胞免疫染色强度，并计算每只荷瘤大鼠5 张切片5 个视野下的平均IOD 值。

1.4 统计学方法本实验结果均为计量资料，以均值±标准误表示，采用统计软件SPSS 17.0 中的两独立样本t 检验分析灌注参数（rCBV 值和PS 值）在瘤周组织和对侧脑组织的差别。AQP-1 在瘤周水肿组织中表达的IOD 值与rCBV 值和PS 值的相关性采用Pearson 相关分析法进行检验，得出两者的相关系数并进行t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRI 检查结果本组实验接种的C6 胶质瘤大鼠模型均于3～4 周完成MRI 扫描。此阶段胶质瘤瘤体信号不均匀，T1WI 呈等或稍低信号，T2WI 和T2 flair 以高信号为主，注射对比剂后胶质瘤多呈环形强化或均匀强化，瘤周水肿则呈现长T1 长T2 信号，注射对比剂后无强化。对照组大鼠脑实质MRI 各序列均未发现异常。荷瘤大鼠瘤周水肿组织rCBV 值和PS 值均较正常侧脑组织升高，且差异具有统计学意义（P ＜0.05），见表1 及图1。

表1 瘤周水肿组织和正常侧脑组织rCBV 值和PS 值比较结果Tab.1 Comparison of rCBV value and PS value between peritumoral edema tissue and contralateral brain tissue ±s

表1 瘤周水肿组织和正常侧脑组织rCBV 值和PS 值比较结果Tab.1 Comparison of rCBV value and PS value between peritumoral edema tissue and contralateral brain tissue ±s

部位指标rCBV PS瘤周244.34±45.96 1.32±0.13对侧205.18±30.46 0.35±0.05 t 值4.02 38.69 P 值＜0.05＜0.05

2.2 病理结果所有细胞接种后成活大鼠经病理证实均有瘤体形成，瘤周水肿组织结构疏松，部分细胞胞浆空泡变，细胞间隔增宽，间质疏松水肿，散在不同程度的肿瘤细胞浸润。AQP-1 抗体免疫组化染色部位在异常星形细胞包膜、胞浆及血管内皮细胞中表达，瘤周水肿组织AQP-1 表达的IOD值为（76 595.35 ± 9 291.12）。Pearson 相关分析显示，瘤周水肿组织rCBV 值和PS 值分别与AQP-1 阳性表达IOD 值间均存在正相关（r1=0.51，r2=0.49，P ＜0.05）。见图2、3。

图2 HE 染色示瘤周脑组织神经元数量减少（HE，×200）Fig.2 HE staining showed that the number of neurons in the peritumoral brain tissue decreased（HE，×200）

图3 免疫组化示瘤周浸润的肿瘤细胞和内皮细胞AQP-1表达阳性（SP，×200）Fig.3 Immunohistochemistry showed positive expression of AQP-1 in tumor cells and endothelial cells in peritoneal infiltration of tissue（SP，×200）

3 讨论

胶质瘤作为颅内最常见的原发性恶性肿瘤，其生长依靠充足的血流供应，一旦这先决条件得到满足，肿瘤细胞的浸润和转移也得以触发。可以说在没有血管供应的阶段，肿瘤细胞生长的直径多不会超过2 mm，而一旦拥有丰富血管新生，就可以使肿瘤细胞依靠足够的血供和营养促进自身生长和迁徙、移动。新生血管结构具有结构不完整，成熟度不高，比正常成熟血管具有更高的通透性。PWI 利用分析检测含对比剂的血液首次通过瘤体及瘤周新生血管时随时间变化的组织信号强度，计算出感兴趣区rCBV 及PS 值等血流动力学参数。其中rCBV 值代表组织血容量，与微血管密度（microvessel density，MVD）成正比，代表新生血管的丰富程度，PS值也可用来反映新生血管生成的速率［9］，二者联合可较全面的反映肿瘤新生血管的情况，对了解肿瘤的生物学特性提供了客观依据。

本研究选择的时间节点为C6 胶质瘤细胞接种后3～4 周，此阶段肿瘤级别多较高，瘤周水肿明显，肿瘤浸润性显著，适合评估胶质瘤新生血管情况。研究显示在胶质瘤生长阶段晚期，其血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）多有破坏，通透性增高，在首次团注对比剂后，会出现对比剂通过不完整的BBB 渗透到细胞外间隙的现象，这一结果会通过改变血管内外对比剂浓度梯度差异引起组织信号弛豫效应增高，随之信号降低程度缩小，获得的灌注参数rCBV 值偏低［10］。考虑到3～4 周的C6脑胶质瘤新生血管非常丰富，各种管径的新生血管均存在，SE-EPI 序列仅对正常毛细血管灌注敏感，容易低估此阶段胶质瘤灌注情况，本研究首选GRE-EPI 序列作为磁共振灌注成像的扫描序列，这和国外研究结果［10］相似。同样为了提高胶质瘤瘤体和瘤周组织界定的准确性，本研究参照国内文献［8］除包括T2WI 和T1WI 增强序列，还额外增加T2-Flair 和T1-3D-Bravo 容积增强扫描，以期三维立体、动态化界定胶质瘤瘤体、瘤周组织并全面评估感兴趣区的内部结构，达到精准定位。在细胞接种后3～4 周后，瘤周水肿组织织rCBV 值和PS值均较正常侧脑组织升高，且差异有统计学意义。这一观点也得到国外学者WEBER 等［11］支持，其团队在研究单发转移瘤瘤周水肿和高级别胶质瘤瘤周水肿的差异时发现，灌注参数之间存在距离差异，尤其是高级别胶质瘤瘤周水肿区的灌注参数较正常侧脑组织明显升高，即近胶质瘤瘤体边缘的瘤周组织的灌注参数rCBV 值较远离瘤体边缘的区域的灌注参数rCBV 值明显升高。而VEERAVAGU 等［12］通过建立小鼠（GL26）胶质母细胞瘤模型研究PWI 在其新生血管评估中的应用价值时认为，肿瘤血管的通透性与VEGF 和新生血管密度存在一定的相关性，从理论上讲，胶质瘤生长处于血管形成期时，因恶性程度高，需要丰富的血流供应，而这些新生血管发育不成熟，结构不完整，管壁薄、管径小，因此血管通透性也就越高，反映了胶质瘤新生血管在生物学特性上的一致性。本文所有接种大鼠瘤周组织内，在光镜下均可发现分化程度不同的新生血管及浸润的胶质瘤细胞，新生血管可促进肿瘤细胞浸润，而浸润的肿瘤细胞也会加速肿瘤血管的新生，二者存在相互促进作用。在一定程度上可以说胶质瘤新生血管的数量和不成熟性与瘤周水肿组织血容量和血管通透性成正相关。

AQP-1 主要表达在胶质瘤星形细胞和血管内皮细胞的细胞膜上表达，且胶质瘤级别越高，AQP-1表达越明显。研究显示AQP-1具有多种功能，除了跨膜转运水分子之外，还通过Lin7/beta-catenin 介导的细胞转运机制促进内皮细胞迁移［13］。可以说，血管内皮细胞的迁移在胶质瘤新生血管形成过程中至关重要。其中，VEGF 作为血管生成过程中最关键的刺激因子，能与内皮细胞受体特异性结合直接刺激血管内皮细胞增殖，促进内皮细胞迁移，诱发新生血管形成，这种机制形成的肿瘤血管内皮细胞不完整，通透性增加［14］。磁共振灌注参数rCBV值和PS 值能够准确反映胶质瘤瘤体及瘤周水肿组织血流动力学方面的信息，而AQP-1具有通过分泌VEGF 促进血管内皮细胞迁移的功能，不仅有助于增加新生肿瘤血管的数量，而且改变了新生血管的功能。本研究中接种的C6胶质瘤大鼠模型在3～4周后接受PWI 扫描，发现瘤周水肿组织AQP-1阳性表达IOD 值与rCBV 值和PS 值均存在正相关。因此可以利用灌注参数rCBV 值和PS 值反映瘤周水肿组织中AQP1 的表达水平，以实现用可视化的影像学表现反映在分子水平发生的不可见的变化，类似于国内学者通过磁共振弥散张量成像参数各项异性分数（fractional anisotropy，FA）间接反映胶质瘤瘤周水肿组织AQP-1的表达水平［15］。

总之，AQP-1 具有促内皮细胞增殖的作用，能够刺激VEGF 分泌，参与并加速血管内皮细胞迁移，在增加胶质瘤新生血管数量和提高血管通透性方面具有重要作用；PWI 凭借多种灌注参数值（rCBV 与PS 值）可全面准确的反映胶质瘤新生血管的量和质的情况，因此研究胶质瘤瘤周组织AQP1 阳性表达与灌注参数（rCVB 和PS 值）的相关性是可行的，且有重要的临床意义。本研究结果认为3～4 周大鼠移植C6 胶质瘤瘤周水肿组织灌注参数rCBV 值和PS 值均较正常侧脑组织升高，并可以体现瘤周水肿组织AQP-1 的阳性表达水平，这有助于将不可见的分子水平的变化转变成可见的影像学表现并加以量化。