rno-miR-16-5p 靶基因预测、生物信息学分析及鉴定

王芳 潘茂兴，2 蔡三金 梅志刚 冯知涛，2

1三峡大学医学院国家中医药管理局中药药理科研三级实验室（湖北宜昌443002）；2暨南大学医学院（广州510632）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类单链非编码小分子RNA，通过碱基互补配对原则与特定靶基因的信使RNA（message RNA，mRNA）的3′-UTR区结合，起到抑制mRNA 翻译或直接降解其特定mRNA 的作用［1］。miRNA 在细胞生长发育、分化、凋亡等方面扮演重要角色［2］，超过50%的miRNA 位于与癌症相关脆弱区和DNA 断裂点上［3］，且miRNA 的表达失调可参与控制脊索瘤［4］、乳腺癌［5］、结肠癌［6］等多种疾病的进程。目前许多miRNA 的靶基因尚未明确，探索其具体作用机制仍较困难，因此利用生物信息学准确预测miRNA 的靶基因，结合双荧光素酶报告实验进行靶基因鉴定对研究miRNA的后续作用机制显得尤为重要。

miR-16 在研究慢性淋巴细胞白血病时被发现［7］，可以通过靶向调控细胞周期素D1等基因诱导细胞周期阻滞从而参与细胞周期进程的调控［8］。miR-16 被证实为肿瘤抑制因子，它的下行调节可以影响肿瘤细胞的凋亡［9］，且与类风湿关节炎的发生发展密切相关［10］。研究［11］表明，miR-16 参与重度抑郁症的形成，提示miR-16 可能是调控神经细胞的一个重要miRNA。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可能是miR-16 的下游靶基因之一［12］，但对其确切性及具体机制的研究甚少。本实验通过miRNA 靶基因数据库预测rno-miR-16-5p 的靶基因，利用基因本体论（gene ontolog，GO）注释对靶基因进行分子功能和生物学分类，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）软件对靶基因富集的信号通路进行富集性分析，并构建双荧光素酶报告实验载体，对预测出的靶基因进行鉴定，为挖掘rno-miR-16-5p 的功能奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料蛋白胨、酵母提取物购自OXOID（英）公司；限制性内切酶（XhoI、NotI）、Phusion DNA 聚合酶、连接反应液、普通DNA 聚合酶购自Thermo 公司；DH5α 感受态细胞、Universal DNA Purification Kit DNA 纯化回收及TIANprep Mini Plasmid Kit 质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖购自BioWest（西班牙）公司；氨苄青霉素购自sigma 公司；Dual-Glo®Luciferase Assay System 购于Promega（美国）公司；LipofectamineTM2000 购于Invitrogen（美国）公司；DEME 培养基与胰酶购于GIBCO（美国）公司。

1.2 实验方法

1.2.1 rno-miR-16-5p 靶基因预测利用miRanda（http：//www.microrna.org）、miRDB（http：//www.mirdb.org）、TargetScan（http：//www.targetscan.org）3 个数据库预测rno-miR-16-5p 的靶基因，取三者结果的交集以减少假阳性。

1.2.2 GO 分析与KEGG 通路分析将预测到的靶基因集合集进行GO 和KEGG 分析。GO 分为生物过程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和细胞组件（cellular component，CC）3 个层面，并利用超几何分析检验法进行统计学分析，以P ＜0.01 为显著性阈值分别得到GO 注释显著性分析。KEGG 通路分析利用Fisher Exact Test 计算P 值，以P ＜0.05 得到差异具有统计学意义的疾病通路及信号转导。

1.2.3 双荧光素酶报告载体的构建通过美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NICB）基因库查找大鼠BDNF 基因3′-UTR序列（NM_012513），应用软件设计扩增引物，引物序列为：r-BDNF_3′-UTR_F：GGCGGCTCGAGTGTTGCCGTTGCCAAGAAT；r-BDNF_3′-UTR_R：AATGCGGCCGCCCTGACCCATGCCAGAAGA。下划线为XhoI、NotI 的酶切位点序列，预计引物扩增长度为573 bp。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以C6 基因组DNA 为模板，采用30 μL 反应体系进行PCR 扩增，1.5%琼脂糖电泳分析，限制性内切酶XhoI、NotI 双酶切上述纯化产物和pmiR-RBREPORTTM 载体，酶切后回收产物进行纯化、连接、转化，挑取转化后的5 个菌落进行PCR 验证，条带理论大小为850 bp。

1.2.4 细胞的瞬时转染取对数生长期的293T 细胞接种于96 孔板中（每孔1.5 × 104细胞，总体积100 μL），37°C培养箱中培养24 h。取10 μL OPTIMEM 培养基稀释miRNA mimic（miRNA 模拟物，试验组）或Non-target Control（NC，阴性对照组），15 μL OPTI-MEM 培养基稀释BDNF 基因3′-UTR双荧光素酶报告基因载体，25 μL OPTI-MEM 培养基稀释0.25 μL LipofectamineTM2000 试剂，混匀后静置20 min。96 孔板中每孔吸走50 μL 培养基后加入上述50 μL 混合液，每组设3 个复孔。6 h 后再加100 μL 新鲜培养基。

1.2.5 rno-miR-16-5p 靶基因的验证细胞转染后48 h，加入1 ×PBS 与luciferase 底物（35 μL 每孔），震荡10 min 后测定萤火虫荧光值；再加入Stop reagent（30 μL），震荡10 min 后测定海肾荧光值。

1.3 统计学方法实验数据应用SPSS19.0 软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，采用t 检验进行两组间比较，P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 靶基因的预测结果采用TargetScan、miRDB、miRanda 数据库预测出的靶基因分别有1 633、737、640 个，为减少假阳性，取三者交集得到的靶基因有48 个（图1）。

2.2 靶基因GO 分析结果对以上48 个预测靶基因进行GO 分析，在BP 层面，靶基因主要富集于细胞生长发育、促进突触合成及神经系统发育等与神经细胞有关的GO 条目中（P ＜0.01）。在CC 层面，靶基因主要富集于血小板α 颗粒、力蛋白复合体等GO 条目中（P ＜0.01）。在MF 层面，靶基因主要富集于粘多糖聚集GO 条目中（P ＜0.01）。其中在符合条件的GO 条目中几乎所有BP 层面的基因功能注释均有BDNF 出现（图2）。

图1 TargetScan、miRDB、miRanda 对rno-miR-16-5p 靶基因的预测结果Fig.1 The prediction results of rno-miR-16-5p target genes of TargetScan，miRDB and miRanda

2.3 靶基因集KEGG 通路分析结果在GO 注释分类的基础上，通过对靶基因集合的KEGG 分析发现靶基因主要富集于4个生物学通路中（P ＜0.05），分别为唾液分泌通路（Salivary secretion）、mTOR信号通路（mTOR Signaling pathway）、cAMP 信号通路（cAMP Signaling pathway）与胰腺分泌通路（Pancreatic secretion），其中BDNF 参与cAMP 信号通路（图3）。

2.4 BDNF 基因3′-UTR 区双荧光素酶基因报告载体的构建通过PCR 扩增BDNF 基因3′-UTR 片段，得到长度为573 bp 的片段，与预期相符（图4）。随后经双酶切试验，选取5 个菌落进行菌落PCR 鉴定，结果发现，挑取的5 个单克隆有4 个长度为850 bp 为阳性克隆，与预期一致（图5）。表明双荧光素酶报告实验载体构建成功。

图2 rno-miR-16-5p 预测靶基因集GO 分类图Fig.2 GO terms of predicted target genes of rno-miR-16-5p

图3 rno-miR-16-5p 预测靶基因KEGG 分类图Fig.3 KEGG terms of predicted target genes of rno-miR-16-5p

图4 BDNF 基因3′-UTR 序列PCR 电泳结果Fig.4 PCR amplification product of BDNF gene 3′-UTR

图5 转化菌落PCR 电泳分析结果Fig.5 PCR amplification product of transformed colony

2.5 rno-miR-16-5p 的靶基因鉴定为了检测rnomiR-16-5p 对BDNF 基因3′-UTR 区的调控作用，对荧光素酶的活性进行了检测。结果显示，rno-miR-16-5p mimic 对BDNF 野生型的报告荧光有显著的下调作用（t = 48.99，P = 0.000），提示BDNF 是rnomiR-16-5p 的靶基因（图6）。

图6 双荧光素酶报告结果Fig.6 The results of dual luciferase reporter gene assays

3 讨论

miR-16 在肿瘤、神经系统疾病等疾病中发挥重要作用。miR-16 的下调可通过孕激素介导的致癌基因信号促进乳腺癌的发展［13］；miR-16 通过靶向肝癌衍生生长因子从而抑制非小细胞肺癌中肿瘤细胞的增殖与侵袭［14］。研究［11］发现，miR-16对人类和啮齿动物神经系统功能相关的基因表达进行多效调节，导致“抗应激”的行为表现；miR-16的表达水平与胶质母细胞干细胞的分化呈正相关，但对胶质母细胞瘤细胞的运动性有负面影响［15］，并且miR-16 可作为抑郁症等疾病的早期诊断指标［16］，但是miR-16 在神经功能调节中的具体机制鲜有文献报道。本实验利用TargetScan、miRDB、miRanda 数据库预测rno-miR-16-5p 的靶基因分别有1 633、737、640 个，取三者的交集靶基因共48 个，包括BDNF、VEGFA 等，具有高特异性及低假阳性率，其中miR-16 可通过抑制多发性骨髓瘤中VEGFA 的表达来调节抗肿瘤免疫［17］，而有关rno-miR-16-5p 靶基因之一BDNF 的文献资料较少，因此对靶基因BDNF 的生物信息学分析及鉴定具有一定的意义。

为了进一步揭示rno-miR-16-5p 的生物学功能，本实验对预测的靶基因集进行了GO 与KEGG分析，结果显示，rno-miR-16-5p 靶基因功能富集于细胞生长发育、促进突触合成及神经系统发育等生物学过程；血小板α颗粒、力蛋白复合体等细胞组件；粘多糖聚集等分子功能。rno-miR-16-5p 靶基因集通路富集于唾液分泌通路、mTOR 信号通路、cAMP 信号通路与胰腺分泌通路。其中BDNF参与了上述几乎所有的生物学过程和cAMP 信号通路，提示BDNF 可能通过cAMP 信号通路调控多个生物学过程。cAMP 信号通路又称为蛋白激酶A 系统（protein kinase A system，PKA），是环核苷酸系统的一种，可通过活化cAMP 依赖的PKA 使下游靶蛋白磷酸化，从而影响细胞代谢和细胞行为［18］。研究［19］表明，PKA 磷酸化的α-氨基羟甲基恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox-azolepropionate，AMPA）受体亚基对突触可塑性有重要作用，而AMPA 受体可介导中枢神经系统兴奋性突触传递，且PKA 可促进短期记忆转化为长期记忆来储存［20］，提示cAMP 信号通路可能是一条重要的与神经系统功能相关的通路。

BDNF 是哺乳动物中枢神经系统中最丰富的神经营养因子，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用［21］。研究［22］发现BDNF 水平下降与癫痫患者认知障碍有关，且是抗抑郁药效的基本决定因素［23］。为了验证BDNF 是否为rno-miR-16-5p的靶基因之一，本研究成功构建了野生型双荧光素酶报告实验载体，并检测荧光素酶的活性来观察rno-miR-16-5p 对BDNF 基因3′-UTR 区的调控作用，结果显示，rno-miR-16-5p mimic 组报告荧光显著减少，表明BDNF 是rno-miR-16-5p 的靶基因。本研究存在不足之处，在后续研究工作中会进一步完善关于突变型BDNF 基因3′-UTR 区双荧光素酶基因报告，进一步证实rno-miR-16-5p 与靶基因BDNF 的调控关系。

综上所述，BDNF 是rno-miR-16-5p 的靶基因之一，结合GO 与KEGG 分析结果，提示rno-miR-16-5p 可能靶向作用于BDNF，再可能通过参与cAMP信号通路调控细胞生长发育、监管轴突生成、促进神经系统发育等生物学过程，但其具体的分子机制尚未明确，需进一步探讨。