斯钙素2在高糖诱导的肝细胞炎症反应中的作用机制

陶文玉 陈郊丽 李晓进 熊煜欣 洪超 王晓苓

1 云南省第二人民医院（昆明650021）；2中国医学科学院和北京协和医学院医学生物学研究所（昆明650031）

糖尿病是一种内分泌代谢性疾病，显著的特点之一是体内胰岛素的降低，血糖的升高，影响糖尿病治疗最主要的因素是安全有效药物的缺乏［1］。研究发现，糖尿病与肝癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等肿瘤的发生存在密切关系。大量的研究表明，糖尿病患者罹患肝癌的风险显著高于非糖尿病患者，而糖尿病一线治疗药物二甲双胍和噻唑烷二酮类化合物（胰岛素增敏剂）的使用能够降低肝癌高风险人群罹患肝癌的几率［2-4］。但在2 型糖尿病的二甲双胍临床治疗中，部分患者出现诸如腹痛等胃肠道不良反应，其中以乳酸酸中毒最为危险［5-6］。而胰岛素作为糖尿病治疗的最有效药物，同样也存在一定的不足，胰岛素可以直接通过影响胰岛素样生长因子受体（IGFs）参与肿瘤的发生［7］。因此寻找新颖的糖尿病治疗靶点，并鉴定其分子机理，对于开发新的糖尿病治疗药物具有非常重要的意义，同时对于深入了解并干预糖尿病慢性并发症，如肝损伤、肾脏损伤等，也具有广阔的前景。本研究从糖尿病性肝病中的肝脏炎症入手，通过分析多个糖尿病肝病动物模型发现在糖尿病模型组中肝脏STC2 的表达显著增加，而炎症信号通路在糖尿病性肝病的发生发展过程中发挥重要的功能，那么STC2 是否通过调控炎症信号通路参与糖尿病性肝病的发展？这对于深入分析并开发针对糖尿病性肝脏炎症的干预方法具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂RPMI1640 培养基，青霉素-链霉素（10 000 U/mL），脂质体转染试剂lipofectamine 2000，购自赛默飞世尔科技公司；胎牛血清（FBS）来自于Gibco；MTT（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide）、G418 硫酸盐和Dglucose 购买于Sigma 公司；RNA 提取试剂盒Trizol、反转录试剂盒来源于上海源叶生物技术公司；qPCR SYBR®定量试剂盒购自Takara 公司；引物序列根据NCBI 设计工具Primer-BLAST 设计，并由华大基因合成，经PAGE 纯化，引物序列如下，STC2（human）：上游引物5′-TCTTGTGAGATTCGGGGC TT-3′，下游引物5′-ACAGGTCGTGCTTGAGGTAG-3′；IL-6（human）：上游引物5′-ACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′，下游引物5′-CCATCTTTTTCAGCCATCTTT-3′；TNFα（human）：上游引物5′-CCCGAGTGACAAGCCTGTAG-3′，下游引物5′- GATGGCAGAGAGGAGGTTGAC-3′；GAPDH（human）：上游引物5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，下游引物5′-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3′；STC2（mouse）：上游引物5′-CTGGGCCAGTTTGTGACCC-3′，下游引物5′-ACGTCATGCAAATCCCATGTAAA-3′。STC2 抗体、β-actin 抗体、辣根过氧化物酶标记的鼠/兔二抗购买自Santa Cruz 公司；磷酸化p65（p-p65）抗体、p65 抗体、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗体、STAT3 抗体来源于CST 公司。

1.2 细胞株正常肝细胞株LO2，来源于美国标准生物品收藏中心（ATCC），传代次数不高于5 次，保存于液氮中。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和质粒转染LO2 正常肝细胞培养在添加10% FBS 和100 U/mL 青霉素-链霉素试剂的RMPI 1640 培养基中，在细胞培养箱中培养，培养条件为5%CO2，温度为37 ℃。在LO2 细胞中转染pcDNA3.1（+）-STC2 质粒采用lipofectamine 2000 脂质体试剂，细胞密度约60%，更换低浓度血清的培养基（reduced serum opti-medium）。转染操作方法按照说明书所述，转染6 h 后吸去孔内培养基，更换含10%FBS 的完全培养基继续培养。

1.3.2 构建稳定过表达STC2 的肝细胞株STC2全长cDNA 序列克隆到含有新霉素抗性基因的pcDNA3.1（+）载体中，使用lipofectamine 2000 脂质体试剂转染到LO2 细胞中，转染培养48 h 后，加入100 μg/mL 的G418 筛选浓度筛选阳性细胞，挑取3个单克隆细胞并进行扩大培养。qRT-PCR 和Western Blot 分析细胞中STC2 表达水平，进行鉴定。鉴定成功后，后续培养继续维持25 μg/mL 的G418，防止抗性丢失。

1.3.3 实时荧光定量PCR 检测细胞经过RNA提取试剂Trizol 裂解5 min，加入氯仿，充分混匀，室温静置分离。高速离心后，吸取上层溶液，经异丙醇沉淀后，再用75%的乙醇溶液洗涤两次，加入DEPC 水溶解，得到总RNA。得到的总RNA 经过基因组DNA 去除剂处理，按照反转录试剂说明书进行反应。获得的cDNA 产物测定浓度后，调整到100 ng/mL，用于荧光定量PCR 检测。实时荧光定量PCR 采用SYBR®Green 试剂盒，反应体系配制比例参照说明书。荧光定量PCR 数据的显示采用Ct 值，数据的分析采用2-ΔΔCt法。

1.3.4 Western Blot 检测在不同时间梯度下，高糖处理LO2 细胞，冰PBS 溶液轻轻洗涤细胞一次，刮取细胞，加入RIPA 裂解液冰上裂解细胞20 min，15 000 g 离心10 min，吸取上清溶液到新的离心管中。加入loading buffer 后99 ℃处理10 min，立即置于冰上，即可进行SDS-PAGE 凝胶电泳电转。采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，经过TBST 溶液洗涤3 次后，4 ℃孵育一抗过夜。再次TBST 溶液摇床上洗涤3 次，每次10 min，室温孵育二抗1 h，TBST 溶液充分洗涤3 次后，每次10 min，进行ECL 化学发光检测。蛋白表达水平的相对定量使用Image J 软件进行灰度密度值分析。

1.3.5 MTT 法检测细胞增殖调整细胞悬浮液的细胞密度至5×104cells/mL，于96 孔细胞培养板中加入100 μL 细胞悬浮液。培养过夜后，加入Dglucose 30 mmol/L，继续培养24 h 后，加入MTT 溶液，每孔加入50 μg 的MTT，继续培养3 h，小心移去孔内培养基。每孔中加入100 μL 的DMSO 溶液，室温振荡5 min，充分溶解紫色结晶后，于酶标仪490 nm 波长下测定吸光值。

1.3.6 差异基因GEO筛选高脂饮食喂养C57BL/6 小鼠21 周，诱导糖尿病相关模型，分析肝脏中基因表达变化，GEO 参考号为GSE24031，测序芯片平台为GPL1261，分析了10 只正常饮食小鼠和8只高脂饮食诱导组，通过GEO 自带的数据分析工具分析STC2 的相对表达变化。

1.3.7 链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病肝病模型小鼠分析肝脏中STC2 的表达变化，STZ 的溶媒为1%的吐温80 溶解于生理盐水中，将含有0.02 mol/L的STZ 的诱导剂以100 mg/kg 的剂量尾静脉注射C57BL/6 小鼠，小鼠全部选用10 周龄雄鼠，对照组注射相应体积的溶媒溶液，对照组和诱导组小鼠数量均为8 只。诱导72 h 后，开始禁食过夜，测定空腹血糖，超过12 mmol/L 定义为糖尿病小鼠。而临床治疗中发现部分糖尿病患者表现出肝损伤等肝病表征，因此把糖尿病并发的肝损伤也称之为糖尿病肝病，本研究通过检测小鼠天冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）等肝脏生化功能指标，确定糖尿病肝病模型的成功构建［8］。处死小鼠，解剖取肝脏，经过冰冷PBS 溶液清洗后，加入液氮进行研磨，加入RNA 提取试剂，进行荧光定量PCR 操作。对比正常组小鼠，分析糖尿病诱导模型组小鼠肝脏中STC2 的表达水平变化。

1.4 统计学方法本文数据的处理均采用Graph-Pad Prism7 软件进行作图和统计分析，实验数据的表示以均数±标准差的方式。两组间比较采用Student′s t 检验，P ＜0.05 表示差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 在糖尿病性肝病模型小鼠中STC2 的表达显著增加通过分析高脂饮食（HFD）诱导的糖尿病模型小鼠中的肝组织基因水平变化，发现与正常饮食组（NFD）小鼠STC2 基因在糖尿病性肝病模型小鼠肝脏中显著增加约10%（图1A）。为了进一步证实在糖尿病性肝病发病过程中STC2 基因的表达变化，通过STZ 尾静脉注射诱导糖尿病肝病模型小鼠，通过分析小鼠肝脏生化指标ALT、AST 确认糖尿病肝病模型的成功建立（图1C-D）。同时通过qRT-PCR 分析肝脏中STC2 的表达，同样发现在糖尿病肝病模型小鼠肝脏中STC2 的表达水平显著增加（P ＜0.01，图1B）。

图1 在高脂饮食和STZ 诱导糖尿病小鼠肝脏中STC2 表达显著增加Fig.1 The expression of STC2 in the liver was elevated in HFD and STZ-induced diabetic disease model

2.2 高糖诱导肝细胞中STC2 表达，并促进炎症因子TNF-α 和IL-6 的表达通过体外高糖诱导处理正常肝细胞LO2，发现高糖能够诱导STC2 蛋白表达增加，并且呈时间依赖性的关系（图2AB），荧光定量PCR 结果也发现高糖能够促进STC2 的mRNA 表达上调（图2C）。同时分析了高糖诱导下，炎症因子TNF-α 和IL-6 的表达变化，发现高糖在诱导STC2 表达的同时，也大量诱导促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表达。这一结果说明，在高糖的刺激下，肝细胞存在炎性响应反应，并且STC2 的蛋白和mRNA 表达也被大量诱导表达。

图2 高糖诱导肝细胞STC2 表达上调，并促进促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表达Fig.2 High glucose could induce upregulation of STC2 and enhanced the expression of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-6

2.3 在高糖条件下，STC2 的表达与促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表达存在正相关的关系通过皮尔森系数（Pearson ratio）分析STC2 与TNFα 的表达相关性，发现在高糖刺激下，STC2 的表达与IL-6 的相关系数为0.748 8，95%置信区间为0.168 5 至0.943 7，由此可见，STC2 与IL-6 的表达存在较强的相关性（图3A）。而STC2 与TNFα 的相关系数为0.968 4，95%置信区间为0.852 6 至0.993 5，这说明STC2 与TNFα 的表达存在非常强的表达相关性（图3B）。

图3 在高糖刺激下，肝细胞中STC2 的表达与IL-6 和TNF-α 存在正相关的关系Fig.3 Under the condition of high glucose，the expression of STC2 was positively correlated with IL-6 and TNF-α expression in the liver cells

2.4 成功构建稳定过表达STC2 的肝细胞株在正常LO2 肝细胞中构建稳定过表达STC2 的细胞株，通过G418 筛选，选取3 个细胞继续扩大培养，进行Western Blot 检测蛋白表达水平，并通过qRTPCR 检测细胞中mRNA 的表达水平，从图4 中可以看出过表达的三株细胞在蛋白水平和mRNA 水平都显著高于对照组细胞，成功构建稳定过表达STC2 的正常肝细胞。

2.5 高糖刺激下，STC2 促进炎症因子TNF-α 和IL-6 的表达通过过表达STC2 发现，在过表达STC2的LO2肝细胞中，高糖诱导的促炎性因子IL-6和TNF-α表达水平进一步提高，并且在没有高糖刺激下，在肝细胞中过表达STC2 也能够一定程度上增强促炎性因子IL-6和TNF-α的表达（图5）。

2.6 在肝细胞中过表达STC2，促进STAT3 和NFκB 通路的激活通过在LO2 肝细胞中过表达STC2，发现过表达STC2 能够显著激活NF-κB 和STAT3 信号通路（图6），这些证据表明STC2 能够通过激活NF-κB 和STAT3 信号通路，促进促炎性因子IL-6 和TNF-α的表达。

图4 构建稳定过表达STC2 的LO2 肝细胞Fig.4 The construction of stable overexpressing STC2 in LO2 liver cells

图5 在肝细胞中过表达STC2，能够促进高糖诱导的TNF-α 和IL-6 表达Fig.5 Overexpression of STC2 enhanced high glucoseinduced the expression of TNF-α and IL-6 in LO2

图6 在LO2细胞中过表达STC2，激活STAT3和NF-κB通路Fig.6 Overexpression of STC2 could activate the STAT3 and NF-κB pathway

2.7 高糖抑制正常肝细胞增殖，过表达STC2 进一步增强高糖的抑制增殖作用通过MTT 实验发现，高糖刺激下，肝细胞的增殖能力显著下降，而过表达STC2 能够进一步增强高糖所诱导的肝细胞增殖抑制能力。同样值得注意的是，在无高糖应激的情况下，过表达STC2 也能够抑制肝细胞LO2 的增殖（图7）。

图7 高糖抑制肝细胞增殖，过表达STC2 能够增强高糖抑制增殖作用Fig.7 High glucose inhibit the proliferation of liver cells，and overexpression of STC2 could enhance the inhibition of proliferation

3 讨论

糖尿病性肝病是糖尿病的一种并发症，糖尿病与肝病之间存在密切的联系［10-11］。非酒精性脂肪肝就是糖尿病性肝病最显著的病变［12］。而目前针对糖尿病的治疗药物种类很少，也存在多种副作用。因此开发新的糖尿病治疗靶点，特别是针对糖尿病性肝病、糖尿病性肾病等并发症，具有非常显著的研究意义。

本研究主要针对糖尿病性肝病，筛选发现STC2 基因在STZ 诱导的糖尿病性肝病小鼠模型中表达水平显著上升，说明STC2 基因可能参与糖尿病性肝病的发生过程，有可能在糖尿病的病理过程中发挥调控作用。为进一步研究STC2 在糖尿病性肝病过程中潜在的分子功能，通过体外高糖刺激正常肝细胞LO2，发现高糖条件下，能够呈时间依赖性的方式诱导STC2 的表达，而且高糖条件下，促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表达也显著增加，并且通过进一步的分析发现STC2 与TNFα 和IL-6存在较强的正相关关系，这些证据表明STC2 在高糖诱导的肝细胞炎性反应过程中存在某种调控关系。鉴于STC2 在高糖刺激的肝细胞炎性响应过程中的作用，为进一步深入研究STC2 在糖尿病性肝病中的功能，通过过表达STC2，发现在正常肝细胞LO2 中过表达STC2 能够促进高糖诱导的促炎性反应过程，而且在没有高糖的应激条件下，STC2 还能够直接影响TNF-α 和IL-6 促炎性因子的表达。说明在高糖诱导的肝细胞促炎性过程中，高糖能够引起肝细胞中TNF-α 和IL-6 的表达增加，而且高糖能够促进STC2 的表达，而STC2 又能够直接通过影响促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表达，形成这样的促进网络，进一步说明STC2 在高糖刺激的肝细胞炎症反应过程中具有显著的作用。

本研究通过分析炎症信号通路，发现STC2 能够激活STAT3 和NF-κB，而TNF-α 和IL-6 是STAT3和NF-κB 信号通路的重要的靶基因［13-15］，本研究表明STC2 能够通过激活NF-κB 和STAT3 信号通路，促进促炎性因子IL-6 和TNF-α 的表达，而介导高糖诱导的肝细胞炎症反应过程。目前的研究发现在高糖等代谢应激条件下，炎症免疫信号分子发挥重要的功能，这与本研究的结果是一致的，同时本研究也发现STC2 作为一个新颖的分子，不仅参与高糖应激过程，还参与炎症信号网络，因此STC2 在代谢应激和炎症免疫交互调节网路中扮演重要的角色。高糖刺激的促炎性反应过程，往往伴随肝损伤［16］，为进一步深入研究STC2 在高糖促炎性应激过程中对肝细胞的功能，本研究通过肝细胞增殖功能实验，发现高糖诱导的STC2 能够促进高糖应激所引起的肝细胞增殖抑制功能，这进一步说明STC2 不仅参与高糖所诱导的肝细胞炎症反应过程，而且还参与肝细胞的增殖功能调节中。本研究显示STC2 在糖尿病肝病模型小鼠肝脏损伤中以及高糖诱导肝细胞炎症反应过程中都发挥重要的促进作用，因此针对STC2 的抑制剂的开发，也具有广阔的研究前景。综上所述，本研究首次发现STC2 是一个潜在治疗糖尿病性肝病的新颖靶标，在肝细胞中，STC2 能够通过激活STAT3 和NF-κB 通路促进促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表达，并且STC2 还参与肝细胞的增殖生理功能中，为深入了解糖尿病性肝病的发病机理和研究干预策略提供了新的思路。